DB22∕T 3283-2021 豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測 TaqMan熒光定量PCR法

1、ICS 11.220CCS B 41DB22吉林省地方標準DB22/T 32832021豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測TaqMan 熒光定量 PCR 法TaqMan quantitative PCR assay for detection of porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus2021 - 11 - 26 發(fā)布2021 - 12 - 15 實施吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā) 布DB22/T 32832021前言本文件按照 GB/T 1.12020 標準化工作導則第 1 部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專

2、利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本文件由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本文件起草單位：吉林大學。本文件主要起草人：賀文琦、李姿、蘭云剛、趙魁、關繼羽、陸慧君、高豐。IDB22/T 32832021豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測TaqMan 熒光定量 PCR 法1 范圍本文件描述了豬血凝性腦脊髓炎病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法的原理、試驗條件、試劑或材料、儀器設備、樣品、試驗步驟和結果判定。本文件適用于豬血凝性腦脊髓炎病毒的檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引

3、用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 19489實驗室生物安全通用要求GB/T 27401實驗室質量控制規(guī)范動物檢疫3 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1豬血凝性腦脊髓炎病毒porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV引起豬血凝性腦脊髓炎的病原。PHEV為不分段的單股正鏈RNA 病毒，屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Betacoronavirus）成員。4 原理根據PHEV S基因序列設計引物和探針，探針在5端標記FAM熒光素作為報告熒光基團，3端標記TAMRA作為淬滅熒光基團

4、。反應進入退火階段時，引物和探針同時與目的基因片段結合，此時探針上熒光基團發(fā)出的熒光信號被淬滅基團所吸收，儀器檢測不到熒光信號；而反應進行到延伸階段時，Taq酶發(fā)揮53的外切核酸酶功能，將探針降解。探針上的熒光基團游離出來，所發(fā)出的熒光不再為淬滅基團所吸收而被檢測儀所接收。隨著PCR反應的循環(huán)往復，PCR產物呈指數形式增長，熒光信號也相應增長。5 試驗條件5.1 生物安全要求所有培養(yǎng)物和廢棄物的處置應符合 GB 19489 規(guī)定。5.2 防污染措施防止污染措施應符合 GB/T 27401 規(guī)定。5DB22/T 328320216 試劑或材料6.1 M-MLV 反轉錄酶，濃度為 200 U/L，

5、-20 保存。6.2 Taq DNA 聚合酶，-20 保存。6.3 RNase 抑制劑，濃度為 40 U/L，-20 保存。6.4 Oligo（dT）18 引物，濃度為 50 U/L，-20 保存。6.5 dNTP 混合物，濃度為 2.5 mmol/L，-20 保存。6.6 氯仿，常溫保存。6.7 異丙醇，常溫保存。6.8 75 %乙醇，常溫保存，使用前 -20 預冷。6.9 TRIzol 裂解液，常溫或 4 保存。6.10 5×MLV 緩沖液 -20 保存。6.11 10×PCR 緩沖液 -20 保存。6.12 陽性對照樣品，滅活 PHEV 的細胞培養(yǎng)物，Ct 值30。6

6、.13 陰性對照樣品，正常小鼠神經母細胞瘤細胞（N2a 細胞）、豬腎細胞（PK-15 細胞）等，或者經檢測不含 PHEV 的健康豬腦、脊髓組織研磨液。6.14 引物和探針見表 1。引物濃度均為 10 mmol/L，-20 避光保存，6 個月內使用。表1引物和探針序列信息名稱序列（5-3）上游引物FCCAGGATAAATTTCTGTGG下游引物RAACCAGGACTAACCTTTGCTaqMan 探針（FAM）ATGTCCCCACCAAGTATGTTACAGCAAA（TAMRA）7 儀器設備7.1 冰箱，4 冰箱、-20 冰箱和 -70 超低溫冰箱。7.2 高速冷凍離心機，可控溫至 4 ，離心速

7、度不低于 12 000 r/min。7.3 微量移液器，2 L、10 L、50 L、200 L 和 1 000 L。7.4 實時熒光定量 PCR 擴增儀。7.5 組織勻漿儀。7.6 超微量紫外分光光度計。7.7 水浴鍋。7.8 離心管，1.5 mL 無RNase 離心管。7.9 PCR 反應管，根據 PCR 擴增儀要求選擇單管、八聯(lián)排管或 96 孔熒光反應板。8 樣品8.1 樣品采集采集疑似豬血凝性腦脊髓炎病死仔豬的腦、脊髓。用滅菌剪刀和鑷子剪取待檢組織，裝入一次性無菌塑料袋（自封袋），編號，置于冰盒或含有冰袋的保溫箱中，密封運送至實驗室待檢。DB22/T 328320218.2 樣品保存樣品

8、在 2 8 條件下保存應不超過 24 h，若長期保存應置于 -70 超低溫冰箱（7.1）中， 且避免反復凍融。9 試驗步驟9.1 病毒 RNA 提取9.1.1 稱取 1.0 g 待檢樣品于組織勻漿儀（7.5）中，加入 0.2 mL TRIzol 裂解液（6.9）勻漿，使用微量移液器（7.3）吸取至 1.5 mL 無RNase 離心管（7.8）。9.1.2 另取 2 支 1.5 mL 無RNase 離心管（7.8），分別加入陽性對照樣品、陰性對照樣品。9.1.3 向 9.1.1 和 9.1.2 離心管中加入 1 mL TRIzol 裂解液（6.9），劇烈振蕩 15 s，室溫靜置 10 min。采

9、用其他等效的 RNA 提取方法，按照試劑盒說明書進行。9.1.4 加入 200 L 預冷氯仿（6.6），振蕩 15 s，冰上靜置 10 min。9.1.5 4 條件下，高速冷凍離心機（7.2）12 000 r/min 離心 15 min。9.1.6 使用微量移液器（7.3）吸取上層無色水相于新的 1.5 mL 無RNase 離心管（7.8）中。9.1.7 加入等體積預冷異丙醇（6.7），輕輕顛倒混勻，-20 條件下靜置 30 min。9.1.8 4 條件下，高速冷凍離心機（7.2）12 000 r/min 離心 10 min，棄上清。9.1.9 加入 1 mL 預冷的 75 %乙醇（6.8），

10、4 條件下，高速冷凍離心機（7.2）12 000 r/min 離心5 min。9.1.10 重復 9.1.9 操作一次。9.1.11 棄上清，濾紙吸干殘余液體，室溫干燥 2 min。9.1.12 加入 20 L 無 RNase H2O 溶解，超微量紫外分光光度計（7.6）測定核酸濃度。冰浴保存?zhèn)溆谩? 冰箱（7.1）保存不超過 8 h，長期保存應置于 -70 冰箱。9.2 cDNA 模板制備按表 2 中各組分依次加入PCR反應管（7.9），蓋緊管蓋后，瞬時離心 3 s，42 水浴鍋（7.7） 中水浴 1 h；70 水浴鍋（7.7）中水浴 10 min；冰浴 2 min，-20 冰箱（7.1）保

11、存?zhèn)溆?。?反轉錄系配制表試劑用量RNA模板1.0 gOligo（dT）18引物（100 mol/L）1.0 L5×MLV緩沖液4.0 LdNTP混合物（2.5 mmol/L）4.0 LRNase抑制劑（40 U/L）0.5 LM-MLV反轉錄酶（200 U/L）0.5 L無RNase H2O補至 20.0 L9.3 反應體系DB22/T 32832021設定 PCR 反應管數（n+2）×3，其中 n 為待檢樣品數，設陽性對照樣品（6.12）和陰性對照樣品（6.13）各 1管，每個樣品設置 3 次重復反應。按表 3 中各組分依次加入PCR反應管（7.9），蓋緊管蓋后，500

12、 r/min瞬時離心 30 s。表3PCR反應體系配制表試劑用量10×PCR緩沖液2.0 LdNTP混合物（2.5 mmol/L）2.0 L上游引物F（10 mmol/L）1.0 L下游引物R（10 mmol/L）1.0 LTaqMan探針（FAM）（10 mmol/L）1.0 LcDNA模板4.0-40.0 ngTaq DNA聚合酶0.5 L無RNase H2O補至 25.0 L9.4 反應參數將9.3中離心后的PCR反應管（7.9）放入實時熒光定量PCR擴增儀（7.4）內，記錄樣品擺放順序。設定 TaqMan 熒光定量 PCR 檢測 PHEV 核酸的反應參數：第一階段，預讀 50 2 min；第二階段，預變性 95 3 min；第三階段，95 15 s、60 30 s，40 個循環(huán)。熒光收集設置在每次循環(huán) 60 30 s 時進行。10 結果判定10.1 結果分析條件設定根據收集的 Ct 值判定結果。閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性對照樣品擴增曲線的最高點為準。10.2 質控標準10.2.1 陰性對照無 Ct 值并且無擴增曲線。10.2.2 陽性對照 Ct 值30，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。10.2.3 如陰性對照和陽性對照不滿足以上條件，此次試驗視為無效。10.3 結果描