DB22∕T 3283-2021 豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測(cè) TaqMan熒光定量PCR法

1、ICS 11.220CCS B 41DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T 32832021豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測(cè)TaqMan 熒光定量 PCR 法TaqMan quantitative PCR assay for detection of porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus2021 - 11 - 26 發(fā)布2021 - 12 - 15 實(shí)施吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā) 布DB22/T 32832021前言本文件按照 GB/T 1.12020 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專

2、利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本文件起草單位：吉林大學(xué)。本文件主要起草人：賀文琦、李姿、蘭云剛、趙魁、關(guān)繼羽、陸慧君、高豐。IDB22/T 32832021豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測(cè)TaqMan 熒光定量 PCR 法1 范圍本文件描述了豬血凝性腦脊髓炎病毒TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的原理、試驗(yàn)條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟和結(jié)果判定。本文件適用于豬血凝性腦脊髓炎病毒的檢測(cè)。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引

3、用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T 27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1豬血凝性腦脊髓炎病毒porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV引起豬血凝性腦脊髓炎的病原。PHEV為不分段的單股正鏈RNA 病毒，屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Betacoronavirus）成員。4 原理根據(jù)PHEV S基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，探針在5端標(biāo)記FAM熒光素作為報(bào)告熒光基團(tuán)，3端標(biāo)記TAMRA作為淬滅熒光基團(tuán)

4、。反應(yīng)進(jìn)入退火階段時(shí)，引物和探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；而反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶發(fā)揮53的外切核酸酶功能，將探針降解。探針上的熒光基團(tuán)游離出來，所發(fā)出的熒光不再為淬滅基團(tuán)所吸收而被檢測(cè)儀所接收。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長，熒光信號(hào)也相應(yīng)增長。5 試驗(yàn)條件5.1 生物安全要求所有培養(yǎng)物和廢棄物的處置應(yīng)符合 GB 19489 規(guī)定。5.2 防污染措施防止污染措施應(yīng)符合 GB/T 27401 規(guī)定。5DB22/T 328320216 試劑或材料6.1 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶，濃度為 200 U/L，

5、-20 保存。6.2 Taq DNA 聚合酶，-20 保存。6.3 RNase 抑制劑，濃度為 40 U/L，-20 保存。6.4 Oligo（dT）18 引物，濃度為 50 U/L，-20 保存。6.5 dNTP 混合物，濃度為 2.5 mmol/L，-20 保存。6.6 氯仿，常溫保存。6.7 異丙醇，常溫保存。6.8 75 %乙醇，常溫保存，使用前 -20 預(yù)冷。6.9 TRIzol 裂解液，常溫或 4 保存。6.10 5×MLV 緩沖液 -20 保存。6.11 10×PCR 緩沖液 -20 保存。6.12 陽性對(duì)照樣品，滅活 PHEV 的細(xì)胞培養(yǎng)物，Ct 值30。6

6、.13 陰性對(duì)照樣品，正常小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（N2a 細(xì)胞）、豬腎細(xì)胞（PK-15 細(xì)胞）等，或者經(jīng)檢測(cè)不含 PHEV 的健康豬腦、脊髓組織研磨液。6.14 引物和探針見表 1。引物濃度均為 10 mmol/L，-20 避光保存，6 個(gè)月內(nèi)使用。表1引物和探針序列信息名稱序列（5-3）上游引物FCCAGGATAAATTTCTGTGG下游引物RAACCAGGACTAACCTTTGCTaqMan 探針（FAM）ATGTCCCCACCAAGTATGTTACAGCAAA（TAMRA）7 儀器設(shè)備7.1 冰箱，4 冰箱、-20 冰箱和 -70 超低溫冰箱。7.2 高速冷凍離心機(jī)，可控溫至 4 ，離心速

7、度不低于 12 000 r/min。7.3 微量移液器，2 L、10 L、50 L、200 L 和 1 000 L。7.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀。7.5 組織勻漿儀。7.6 超微量紫外分光光度計(jì)。7.7 水浴鍋。7.8 離心管，1.5 mL 無RNase 離心管。7.9 PCR 反應(yīng)管，根據(jù) PCR 擴(kuò)增儀要求選擇單管、八聯(lián)排管或 96 孔熒光反應(yīng)板。8 樣品8.1 樣品采集采集疑似豬血凝性腦脊髓炎病死仔豬的腦、脊髓。用滅菌剪刀和鑷子剪取待檢組織，裝入一次性無菌塑料袋（自封袋），編號(hào)，置于冰盒或含有冰袋的保溫箱中，密封運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室待檢。DB22/T 328320218.2 樣品保存樣品

8、在 2 8 條件下保存應(yīng)不超過 24 h，若長期保存應(yīng)置于 -70 超低溫冰箱（7.1）中， 且避免反復(fù)凍融。9 試驗(yàn)步驟9.1 病毒 RNA 提取9.1.1 稱取 1.0 g 待檢樣品于組織勻漿儀（7.5）中，加入 0.2 mL TRIzol 裂解液（6.9）勻漿，使用微量移液器（7.3）吸取至 1.5 mL 無RNase 離心管（7.8）。9.1.2 另取 2 支 1.5 mL 無RNase 離心管（7.8），分別加入陽性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品。9.1.3 向 9.1.1 和 9.1.2 離心管中加入 1 mL TRIzol 裂解液（6.9），劇烈振蕩 15 s，室溫靜置 10 min。采

9、用其他等效的 RNA 提取方法，按照試劑盒說明書進(jìn)行。9.1.4 加入 200 L 預(yù)冷氯仿（6.6），振蕩 15 s，冰上靜置 10 min。9.1.5 4 條件下，高速冷凍離心機(jī)（7.2）12 000 r/min 離心 15 min。9.1.6 使用微量移液器（7.3）吸取上層無色水相于新的 1.5 mL 無RNase 離心管（7.8）中。9.1.7 加入等體積預(yù)冷異丙醇（6.7），輕輕顛倒混勻，-20 條件下靜置 30 min。9.1.8 4 條件下，高速冷凍離心機(jī)（7.2）12 000 r/min 離心 10 min，棄上清。9.1.9 加入 1 mL 預(yù)冷的 75 %乙醇（6.8），

10、4 條件下，高速冷凍離心機(jī)（7.2）12 000 r/min 離心5 min。9.1.10 重復(fù) 9.1.9 操作一次。9.1.11 棄上清，濾紙吸干殘余液體，室溫干燥 2 min。9.1.12 加入 20 L 無 RNase H2O 溶解，超微量紫外分光光度計(jì)（7.6）測(cè)定核酸濃度。冰浴保存?zhèn)溆谩? 冰箱（7.1）保存不超過 8 h，長期保存應(yīng)置于 -70 冰箱。9.2 cDNA 模板制備按表 2 中各組分依次加入PCR反應(yīng)管（7.9），蓋緊管蓋后，瞬時(shí)離心 3 s，42 水浴鍋（7.7） 中水浴 1 h；70 水浴鍋（7.7）中水浴 10 min；冰浴 2 min，-20 冰箱（7.1）保

11、存?zhèn)溆?。?反轉(zhuǎn)錄系配制表試劑用量RNA模板1.0 gOligo（dT）18引物（100 mol/L）1.0 L5×MLV緩沖液4.0 LdNTP混合物（2.5 mmol/L）4.0 LRNase抑制劑（40 U/L）0.5 LM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/L）0.5 L無RNase H2O補(bǔ)至 20.0 L9.3 反應(yīng)體系DB22/T 32832021設(shè)定 PCR 反應(yīng)管數(shù)（n+2）×3，其中 n 為待檢樣品數(shù)，設(shè)陽性對(duì)照樣品（6.12）和陰性對(duì)照樣品（6.13）各 1管，每個(gè)樣品設(shè)置 3 次重復(fù)反應(yīng)。按表 3 中各組分依次加入PCR反應(yīng)管（7.9），蓋緊管蓋后，500

12、 r/min瞬時(shí)離心 30 s。表3PCR反應(yīng)體系配制表試劑用量10×PCR緩沖液2.0 LdNTP混合物（2.5 mmol/L）2.0 L上游引物F（10 mmol/L）1.0 L下游引物R（10 mmol/L）1.0 LTaqMan探針（FAM）（10 mmol/L）1.0 LcDNA模板4.0-40.0 ngTaq DNA聚合酶0.5 L無RNase H2O補(bǔ)至 25.0 L9.4 反應(yīng)參數(shù)將9.3中離心后的PCR反應(yīng)管（7.9）放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（7.4）內(nèi)，記錄樣品擺放順序。設(shè)定 TaqMan 熒光定量 PCR 檢測(cè) PHEV 核酸的反應(yīng)參數(shù)：第一階段，預(yù)讀 50 2 min；第二階段，預(yù)變性 95 3 min；第三階段，95 15 s、60 30 s，40 個(gè)循環(huán)。熒光收集設(shè)置在每次循環(huán) 60 30 s 時(shí)進(jìn)行。10 結(jié)果判定10.1 結(jié)果分析條件設(shè)定根據(jù)收集的 Ct 值判定結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。10.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)10.2.1 陰性對(duì)照無 Ct 值并且無擴(kuò)增曲線。10.2.2 陽性對(duì)照 Ct 值30，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。10.2.3 如陰性對(duì)照和陽性對(duì)照不滿足以上條件，此次試驗(yàn)視為無效。10.3 結(jié)果描