載體的功能和應(yīng)具備的特點(diǎn)

1、 載體的功能 1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件 載體應(yīng)具備的條件 1.具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有多種單一的酶切位點(diǎn)5.具有合適的選擇性標(biāo)記 H1 design of plasmid vectors H2 bacteriophage vectors H3 cosmids and YACs and BACs H4 eukaryotic vectors Characteristics of plasmid vectors Alteratio

2、n of plasmid vectors Type of plasmid vectors Development of plasmid vector research Familiar plasmid vector Independent from nuclear genome Autonomously replicating nucleic acids sequence Genetic stability Eukaryotic bacterial and epiphyte Most of plasmids consist of DNA. Most of plasmids are cccDNA

3、 (covalent, closed, circle) Mw range ：1 - 300 kb 質(zhì)粒的不相容性 質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制 質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系 根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型： 嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 stringent plasmid 1 - 3 拷貝 松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒 stringent plasmid 10 - 60 拷貝 任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群 以大腸

4、桿菌的質(zhì)粒為例： ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不相容 pSC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不相容 p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不相容 質(zhì)粒不相容性的分子機(jī)制 兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。 兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同

5、質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢。后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢。 革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾?接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等 非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用，如Col、R的其它成員 值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由 bom 和mob 基因決定 野生型的質(zhì)粒DNA上往往

6、攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括： 物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物 物質(zhì)合成：抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿 這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。 目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的： pSC101：8.8 kb，拷貝數(shù)5，四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 Tcr ColE1：6.5 kb，拷貝數(shù)20 30，大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1 RSF2124：ColE1

7、衍生質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質(zhì)粒高拷貝質(zhì)粒:突變拷貝數(shù)控制基因，拷貝數(shù)突變拷貝數(shù)控制基因，拷貝數(shù)1000-3000，擴(kuò)，擴(kuò)增基因增基因 低拷貝質(zhì)粒低拷貝質(zhì)粒:來自來自pSC101,拷貝數(shù)小于拷貝數(shù)小于10,表達(dá)某些毒性基因表達(dá)某些毒性基因 溫敏質(zhì)粒溫敏質(zhì)粒:在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì) 測序質(zhì)粒測序質(zhì)粒:含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker 整合質(zhì)粒整合質(zhì)粒:裝有整合促進(jìn)基因及位

8、點(diǎn)裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn),便于外源基因的整合便于外源基因的整合 穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒:裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子,便于基因克隆便于基因克隆 表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒:裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件件 探針質(zhì)粒探針質(zhì)粒:裝有報(bào)告基因裝有報(bào)告基因,便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選 第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。 第三階段

9、：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。 pBR322 Blue-white screening pUC pUC18 / 19 pKO pGEM-3Z pBR322 has a circle dsDNA of 4.36kb, and the compositive base sequences have been found out. pBR322 has more than 100 restriction site , and scores of single restriction site for e

10、ach restriction enzyme. It and its derivatives contain two antibiotic resistance genes, ampr and tetA. If a target DNA fragment is ligated into the coding region of one of the resistance genes, say tetA, the gene will become insertionally inactivated, and the presence or otherwise of a recombinant p

11、roduct can be determined by the antibiotic resistance exhibited by the transformants.pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr重組DNAAmprTcs提取DNA 電泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉(zhuǎn)化 無菌落陽性菌落篩選重組子2)DNA重組無DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切 Inclusion of

12、 tetracycline in the original selection plate will kill off the recombinant colonies in which we are interested. The colonies grown on a normal ampicillin plate are transferred, using an abosorbent pad, to a second plate containing tetracycline. Colonies which grown on this plate probably contain ve

13、ctor plasmids whereas those which do not are likely to be recombinants. The latter may be picked from the ampicillin plate for further analysis. A more sophisticated procedure for screening for the presence of recombinant plasmids. Only on a single transformation plate This method also involves the

14、insertional inactivation of a gene and uses the production of a blue compound as an indicator. The gene in this case is lacZ, which encodes the enzyme galactosidase, and is under the control of the lac promoter. If the host E.coli strain is expressing the lac repressor, then expression of a lacZ gen

15、e on the vector may be induced using IPTG, and the expressed enzyme can utilize the synthetic substrate X-gal to yield a blue product. Insetional inactivation of lacZ in the production of a recombinant plasmid would prevent the development of the blue color. The transformed cells are spread on to a

16、plate containing ampicillin, IPTG and X-gal, to yield a mixture of blue and white colonies. The white colonies have no expressed -galactosidase and are hence likely to contain the inserted target fragment. The blue colonies probably contain religated vector.pUC質(zhì)粒 pUC質(zhì)粒系列也是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的。 pUC的結(jié)構(gòu)： 它含有

17、pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ 基因及其啟動(dòng)子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker. 三大優(yōu)點(diǎn)EcoSacKpnSma BamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXba BamSma KpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表達(dá)半乳糖苷酶的片段。 LacZ的上游包括乳糖操

18、縱子上的啟動(dòng)子Plac和操縱基因O。 lacZ之內(nèi)是M13的多功能連接器。 分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞含500-700個(gè)拷貝）。 含易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZ，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。 多克隆位點(diǎn)區(qū)（the multiple cloning site, MCS）由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。 其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進(jìn)行DNA測序和體外突變等研究。 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell 裝

19、有多克隆位點(diǎn)（裝有多克隆位點(diǎn)（MCS） 正選擇顏色標(biāo)記正選擇顏色標(biāo)記 lacZ 用于基因克隆和測序用于基因克隆和測序 BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII正選擇標(biāo)記正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理的顯色原理 組成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位點(diǎn)包括terr。 表達(dá)產(chǎn)物催化 Gal + ATP Gal-1-P+ADP 以14C標(biāo)記的半

20、乳糖作底物,檢測生成的*Gal-1-P的放射性。 在Galk基因上游插入目的基因，根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算啟動(dòng)子功能的強(qiáng)弱。 如在Galk基因前插入目的基因，與無插入的空載pKO比較，并無放射活性的增強(qiáng)，則說明插入片段不存在有啟動(dòng)子。 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 多拷貝 裝有多克隆位點(diǎn)（MCS） 正選擇顏色標(biāo)記 lacZ 裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子用于外源基因的高效表達(dá) 注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如E.coli BL21（DE3）等 aCl2轉(zhuǎn)化效率低 克隆片

21、段小于10kb 大量篩選時(shí)需要細(xì)胞裂解 Characteristics of bacteriophage Bacteriophage M13 Virus 噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。 噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋?高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增 Bacteriophage , which infects E.coli cells, can be used as

22、 a cloning vector. The process of infection by phage Structure of phage -DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建 -DNA載體的主要類型載體的主要類型 -DNA重組分子的體外包裝重組分子的體外包裝 -DNA及其重組分子的分離純化及其重組分子的分離純化 -DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)作為載體的優(yōu)點(diǎn) 大腸桿菌的溫和型噬菌體 由外殼包裝蛋白和-DNA組成 線性dsDNA病毒，具有末端互補(bǔ)的12nt（cos），感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀 全長48502個(gè)核苷酸 -DNA上至少有50多個(gè)基因 結(jié)構(gòu)區(qū)：A J共19個(gè)基因，長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)

23、成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì) 重組區(qū) ：att、int及xis，長約20kb，是DNA整合和切出，溶原生長所需的序列 調(diào)控區(qū):長約10kb，包括啟動(dòng)子、終止子和N、CI基因?？刂迫芫腿茉L最重要的調(diào)控基因和序列、以及DNA復(fù)制均在該區(qū)域內(nèi) O-R 為裂解區(qū) 縮短長度縮短長度 刪除并和增加酶切位點(diǎn)刪除并和增加酶切位點(diǎn) 加裝選擇標(biāo)記加裝選擇標(biāo)記 構(gòu)建琥珀密碼子的突變體構(gòu)建琥珀密碼子的突變體 野生型-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型-DNA的長度，可以提高裝載量。

24、 野生型-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除片段長度的不同，可將-DNA分成兩大類載體： 插入型載體 取代型載體 允許外源 DNA 片段替換非必須 DNA 片段的載體，稱為置換型載體（replacement vectors）。 一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是 9-23kb ，故而該載體主要用來構(gòu)建基因組文庫。 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) 野生型的-DNA鏈上有5個(gè) EcoRI 位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個(gè)。 增加新的單一酶切位點(diǎn)增加新的單一酶切位點(diǎn) 為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單

25、一的酶切位點(diǎn)。除了簡單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)。 與質(zhì)粒不同，野生型-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容 加裝于-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類： 免疫功能類標(biāo)記 Imm434 顏色反應(yīng)類標(biāo)記 lacZ imm434基因編碼一種阻止-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。 含有完整標(biāo)記基因的-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑； 當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， -重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。 lacZ基因編碼-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。 當(dāng)外源基因插入到lacZ基

26、因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物； 而空載體-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑 琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG （stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。 將野生型-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。 插入滅活型載體 ：Charon2、Charon6、gt11 取代型載體：EMBL4、gtlc、

27、NM762、Charon40 正選擇型載體：EMBL1、L47、1059 野生型的-噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受-DNA上的red 和 gam 兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代 red 和 gam ，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑。 -DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。 用于體外包裝的蛋白質(zhì)必須具備以下成分：A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（包裝蛋白），D蛋白（插入蛋白）。 可直接從感染了-噬菌體的大腸桿菌中提取這些蛋白，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)商品化。這些包裝蛋白

28、通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。 將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期 加入噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時(shí) 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒密度已達(dá)1013 -1014 / L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放-DNA 乙醇或異丙醇沉淀-DNA 在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于

29、質(zhì)粒的裝載量 重組-DNA分子的篩選較為方便 重組-DNA分子的提取較為簡便 -DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因。因而-DNA可通過人工加入序列的方法構(gòu)建pET載體。 表達(dá)載體 pET-5a 是典型的 pET 載體，其組成是在載體的基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上加入了 T7 噬菌體啟動(dòng)子序列及其下游的幾個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)外源基因插入到這些酶切位點(diǎn)后，就可在特定的宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。 M13噬菌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu) M13 噬菌體的基因組 M13 噬菌體結(jié)構(gòu)模型 M13 噬菌體的感染周期 M13 噬菌體的復(fù)制過程 M13 噬菌體的構(gòu)建 M13 DNA載體的特點(diǎn) M13噬菌體的外型呈絲狀 M1

30、3 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成 M13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長 M13 DNA全長6407個(gè)核苷酸 M13 DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)蛋白外殼分子 ssDNA ，6407 個(gè)核苷酸組成 （GenBank 注冊號為 V00604） ?；蚪M 90% 以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有 11 個(gè)編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個(gè)核苷酸。較大的間隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和 DNA 合成的元件。 其基因組可編碼 3 類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因 ， 和 ），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因， 和 ），結(jié)構(gòu)蛋白（基因 、 和 ）?；蚪M DNA 為正鏈，按

31、基因 至基因 方向合成，與噬菌體的 mRNA 序列同義。 M13 噬菌體顆粒為絲狀長管狀結(jié)構(gòu)，長 880nm ，直徑 6-7nm 。噬菌體顆粒的核心由 2700 個(gè)基因 編碼的結(jié)構(gòu)蛋白呈管狀排列而成，成熟的基因 的產(chǎn)物為由 50 個(gè)氨基酸殘基組成的 螺旋蛋白。頂端由 5 個(gè)基因 和 5 個(gè)基因 產(chǎn)物組成，作用于間隔區(qū)中的包裝信號。 5 個(gè)基因 蛋白和 5 個(gè)基因 蛋白位于絲桿的末端，參與對性纖毛的吸咐。 在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删w DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復(fù)制，因此這種雙鏈 DNA 稱為復(fù)制型 DNA （replicative form

32、DNA） ，即 RFDNA 。通過 復(fù)制方式， RFDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，基因的轉(zhuǎn)錄也隨即開始。 基因組中的任意一個(gè)啟動(dòng)子都可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，單方向地終止于下游的終止子。啟動(dòng)子和終止子的位置關(guān)系使得靠近終止子的基因轉(zhuǎn)錄更頻繁。 +DNA+DNARFDNARFDNARFDNAII 單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)的 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。 使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外，這在DNA定向突變中非常有用。 M13重組分子篩選簡便。 被M13噬

33、菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大。 M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb。 與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病毒基因組DNA。 動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類： ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。 The way to form cosmids Cosmid Phagemid Artificial Chromosomes -

34、噬菌體載體和M13-噬菌體載體的裝載量最大分別為25 kb和1.5kb，裝載量無法滿足現(xiàn)代基因工程的需要。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒。 由于cos質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。 一類人工構(gòu)建的含有-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體。 1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建 1.8 kb的-DNA片段 + pBR322片段 粘粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)

35、制起點(diǎn)（colE1），抗性標(biāo)記（ampr）， cos 位點(diǎn)，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用來克隆大片段 DNA ，裝載范圍為31 - 45 kb。有的粘粒載體含有兩個(gè) cos 位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率。 同-噬菌體，可進(jìn)行體外包裝，高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制 重組操作簡便，篩選容易 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍 不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞 噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體。 噬菌粒的特點(diǎn) 能像M13一樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 能像質(zhì)粒

36、那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制 裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb） 通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA 重組操作簡便，篩選容易 pUC118 / 119， pBluescript體外轉(zhuǎn)錄載體 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 具有多克隆位點(diǎn)、 -互補(bǔ)、噬菌體啟動(dòng)子和單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制與包裝信號 噬菌體啟動(dòng)子PT3和PT7 強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄 提取出來的單鏈DNA重 組分子在噬菌體RNA聚 合酶的存在下，又可實(shí) 現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄 pBluescriptKS（） 一般由 4 個(gè)質(zhì)粒組成一套系統(tǒng)，其差別在于多克隆位點(diǎn)方向相反（根據(jù)

37、多克隆位點(diǎn)兩端 Kpn 和 Sac 的順序，用 KS 或 SK 表示），或單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制啟始方向相反（或者說，引導(dǎo) DNA 雙鏈中不同鏈合成單鏈 DNA ，用 + 或 - 表示）。 pBluescriptKS（） 的多克隆位點(diǎn)與 pUC18/19 的不同，且使用 f1 噬菌體的復(fù)制與包裝信號序列 。 人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千 kb 的DNA片段 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 細(xì)

38、菌人造染色體（BAC） 酵母人造染色體（YAC） 細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，裝載范圍50 - 300 kb之間。 各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝。 BAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒副作用。 pBAC的基因結(jié)構(gòu) pBACs主要適用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫 大腸桿菌的 F 因子是一個(gè)約 100kb 的質(zhì)粒。它編碼60多種參與復(fù)制、分配和接合過程的蛋白質(zhì)。 雖然F因子通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2個(gè)拷貝/細(xì)胞）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少3

39、0個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行隨機(jī)整合。 攜帶F因子的細(xì)胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表達(dá)三根發(fā)樣狀的F菌毛。F菌毛為供體與受體細(xì)胞之間產(chǎn)生性接觸所必需。 每個(gè)環(huán)狀 DNA 分子中攜帶： 一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記 一個(gè)來源于大腸桿菌 F 因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子 oriS 。 一個(gè)易于 DNA 復(fù)制的由 ATP 驅(qū)動(dòng)的解旋酶RepE 以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ）。 Transfection of eukaryotic cells Shuttle vectors Yeast episomal plasmids Agrobacterium

40、tumefaciens Ti plasmid Virus Yeast Artificial Chromosomes DNA transfection into eukaryotic cells can be more problematic than bacterial transformation, and the efficiency to of the process is much lower. Yeast and plant cells: protoplasts Animal cells: calcium phosphate Electroporation Microinjectio

41、n Gene gun 利用脈沖電場改變細(xì)胞膜的狀態(tài)和通透性，達(dá)到將DNA導(dǎo)入細(xì)胞以及促使細(xì)胞發(fā)生融合的目的。 該技術(shù)目前一方面應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，另一方面應(yīng)用于細(xì)胞融合制備雜交細(xì)胞和動(dòng)物克隆等。 將核酸直接發(fā)送至細(xì)胞內(nèi)的物理學(xué)方法。 PDS-1000/H臺式基因槍可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的原位轉(zhuǎn)導(dǎo)。 應(yīng)用于包括培養(yǎng)細(xì)胞、組織、器官、植物、動(dòng)物、細(xì)菌和細(xì)胞器官等各種不同的目標(biāo)。 能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。 如有些載體既能在原核細(xì)胞中復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制，或能在 E.coli 中復(fù)制又能在革蘭氏陽性細(xì)菌中復(fù)制。 這類載體主要是質(zhì)粒載體。 以2質(zhì)粒為基礎(chǔ)

42、的載體 YEps可以含有完整的2質(zhì)粒，也可以只含有2質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)。 YEp13是一個(gè)穿梭質(zhì)粒，含有2質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和選擇基因LEU2, YEp13還包含pBR322的完整序列，因此可以在大腸桿菌也可以在酵母中進(jìn)行選擇。 2質(zhì)粒是非常好的克隆載體，它有6kb大小，在酵母細(xì)胞中的拷貝數(shù)在70-200之間，利用質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，許多酶由寄主細(xì)胞提供，質(zhì)粒中含有編碼蛋白質(zhì)的基因REP1, REP2。 2質(zhì)粒的問題：選擇標(biāo)記的問題。在實(shí)踐中，利用酵母的正常的基因，一般是編碼氨基酸合成的酶，如LEU2基因編碼-異丙基蘋果酸脫氫酶，參與丙酮酸向亮氨酸的轉(zhuǎn)化。為了利用LEU作為選擇標(biāo)記，需要用到一

43、種特殊的寄主，寄主必須是LEU-2營養(yǎng)缺陷體這樣的寄主只有在添加亮氨酸的條件下才能生長。質(zhì)粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培養(yǎng)基上生長。 幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染，而產(chǎn)生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A. tumefaciens）。 其致瘤特性由Ti（tumorinducing）質(zhì)粒介導(dǎo)的。 農(nóng)桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因?yàn)橹参锔繐p傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)可以誘導(dǎo)Vir（Virulence region)基因的啟動(dòng)表達(dá)，Vir基因的產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的一段TDNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產(chǎn)物則與單鏈TDNA結(jié)合

44、，形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。 Ti質(zhì)?；蚪Y(jié)構(gòu) Ti質(zhì)粒大約在160240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區(qū)在36kb左右。除此之外，Ti質(zhì)粒上還存在Con區(qū)（region encoding conjugation)和Ori區(qū)（origin of replication)。 TDNA上有三套基因和左右兩個(gè)邊界。 其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。 第三套基因合成冠癭堿，冠癭堿有四種類型：章魚堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農(nóng)桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine）

45、，使農(nóng)桿菌生長必需的物質(zhì)。 LB和RB是長為25bp的末端反復(fù)重復(fù)順序，在切除及整合過程具有重要意義。 T-DNA切除由Vir區(qū)編碼的特異性內(nèi)切酶完成，分別在LB和RB的第三個(gè)堿基和第四個(gè)堿基之間產(chǎn)生缺口，并形成單鏈T-DNA。 T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不對稱的，RB順序與整合有關(guān)，而LB無關(guān)。 T-DNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯(lián)形式排列，但整合位點(diǎn)的特異性尚未確定。 T-DNA克隆在大腸桿菌質(zhì)粒上，含有E.coli的選擇標(biāo)記和植物選擇標(biāo)記Kmr。 首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源

46、基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。T-DNA重組分子整合到植物細(xì)胞染色體DNA上，Kmr篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 目前T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法是雙元系統(tǒng)，即穿梭質(zhì)粒。插入外源基因的重組穿梭質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化含有Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后直接感染植物細(xì)胞。與共整合系統(tǒng)所不同的是，含外源基因的質(zhì)粒可在農(nóng)桿菌內(nèi)自主復(fù)制并保留下來。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號啟動(dòng)Ti質(zhì)粒上的Vir基因，隨后將穿梭質(zhì)粒的T-DNA切割下來，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。 Baculovirus SV40 Retroviruses 桿狀病毒侵染昆蟲細(xì)胞。 病毒基因組有極強(qiáng)的啟動(dòng)子，可以啟動(dòng)外源基因的過表達(dá)，生產(chǎn)大量目的蛋白

47、。 典型的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是利用大腸桿菌中位點(diǎn)特異的轉(zhuǎn)座或昆蟲細(xì)胞中的同源重組來產(chǎn)生重組桿狀病毒。這些過程要求大量的操作時(shí)間，周期長達(dá)幾周。 BaculoDirect 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可簡化過程，節(jié)省大量時(shí)間。 BaculoDirect系統(tǒng)利用快速、簡便的Gateway技術(shù)。 BaculoDirect線性DNA包含了attR位點(diǎn)，允許與包含有目的基因的Gateway入門克隆進(jìn)行有效的重組。 將entry克隆、BaculoDirect線性DNA和Gateway LR Clonase酶混合物稍加混勻，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)即可。最終的反應(yīng)混和物中包含有攜帶目的基因的桿狀病毒，可以直接用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞（

48、sf9或sf21）。 SV40 infects a number of mammalian species. Its utility for transferring large fragments is limited. 反轉(zhuǎn)錄病毒是一類RNA的病毒，進(jìn)入受體細(xì)胞后，RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，通過兩端由數(shù)百bp組成的長末端重復(fù)序列，整合到染色體上，成為原病毒。 反轉(zhuǎn)錄病毒的DNA基因組的兩端各有一個(gè)長末端重復(fù)序列(5-LTR和3-LTR)，有一個(gè)包裝病毒顆粒時(shí)必需的非編碼序列+，同時(shí)有三個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因gag、pol和env。 反轉(zhuǎn)錄病毒載體可容納外源DNA的長度約10 kb，以很高的轉(zhuǎn)染率感

49、染宿主細(xì)胞，特別是分裂中的細(xì)胞。轉(zhuǎn)入宿主的細(xì)胞后，反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨即整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，這種整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的。 反轉(zhuǎn)錄病毒載體在構(gòu)建時(shí)，刪去了poi、env基因和gag基因的3端，但保留了病毒顆粒所需的+序列。其目的是在于提高載體的安全性，防止反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后進(jìn)行增殖并包裝成病毒顆粒對宿主細(xì)胞造成可能的傷害。在制備反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，必須有一個(gè)輔助細(xì)胞系，這種細(xì)胞內(nèi)有缺陷型病毒可以提供包裝用的外殼蛋白，但自身沒有包裝信號。這樣，反轉(zhuǎn)錄病毒載體就可利用這些外殼蛋白包裝成病毒顆粒在輔助細(xì)胞系內(nèi)大量擴(kuò)增。 反轉(zhuǎn)錄病載體多半用于基因治療，由于病毒載體在宿主細(xì)胞基因組上隨機(jī)插入，可能會引起不安全的后果，這種載體還在不斷改進(jìn)之中。 是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。 釀酒酵母的形態(tài)為扁圓形和卵形，生長的代時(shí)為 90 分鐘；含 16 條染色體，其大小為 225-1900kb ，總計(jì)有14106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。 YAC載體的必需元件 YAC載體的裝載量為350 - 400 kb 酵母人造染色體的使用 YAC 載體的原理性工作流程YAC載體應(yīng)含有下列元件 酵母染色體的