疾控中心檢驗科沙眼衣原體核酸擴增熒光檢測

1、疾控中心檢驗科沙眼衣原體核酸擴增熒光檢測1. 目的：保證CT DNA檢測結(jié)果準確、可靠。2. 適用范圍：CT DNA的 TaqMan熒光定量檢測，標本類型為分泌物。3 負責(zé)人： 操作人：4. 原理： 本試劑盒用一對沙眼衣原體特異引物和一條沙眼衣原體特異性熒光探針，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核苷酸 單體（dNTPS等成分，再用 PCR體外擴增法檢測沙眼衣原體 DNA5. 性能參數(shù)：檢出低值v 25基因拷貝/ml。6. 標本要求：（ 1 ）標本類型： 分泌物。（ 2）標本采集： 見標本采集手冊。（3）標本儲存和運輸：室溫放置不超過 8小時，4-8 C不超過72 小時，-20

2、C保存期6個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融。室溫運輸。（ 4）標本拒收狀態(tài)： 細菌污染標本不能作測定。7. 容器和添加劑類型： 無菌離心管和無菌試管。8. 所需設(shè)備： ABI GeneAmp 5700、臺式高速離心機、混勻器、冰箱（4C、-20 C）、生物安全柜、紫外燈9. 試劑：DNA提取液（500卩1/管）2管；CT-PCR反應(yīng)液（未貼標簽管）20管；陽性定量質(zhì)控標準品（1 X 108基因拷貝/ml ） （50卩1/ 管）1管；陰性質(zhì)控品（250卩1/管）1管。10. 校準程序（計量學(xué)溯源性）：送XXX市計量檢測所校準。11 程序步驟 :：11.1 標本采集、保存和運送男性：取尿道分泌物或細小棉拭子伸

3、入快尿道約24cm略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜） 。將分泌物或棉拭子置入無菌玻璃管，用無 菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。女性：陰道用無菌生理鹽水棉球洗去宮頸外分泌物，再用無菌 棉拭子插入宮頸內(nèi)，停 5 秒鐘后旋動棉拭采取宮頸分泌物，將棉拭子置 入無菌玻璃管，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。尿道用無菌生理鹽水棉球洗凈尿道口，再用無菌棉拭子插入尿道約2cm,略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜）。將棉拭子置入無菌玻璃 管，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。標本可立即用于測試，也可保存于-20 C待測，保存期為6個月。標本運送應(yīng)采用 0 C冰壺。11.2 標本及對照標準品的處理標本試管中加入 1ml

4、無菌生理鹽水,充分震蕩搖勻,吸取液體轉(zhuǎn)至 1.5ml 離心管中 （如分泌物較多, 只取 0.2ml ） 12000rpm 離心 5 分鐘 .沉淀加無菌生理鹽水1ml打勻，12000rpm離心5分鐘,再重復(fù)洗滌一次沉淀直接加50ulDNA提取液充分混勻，（提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì),取 樣時需用加樣器充分混勻后吸取。 如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細不能吸取或取 樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截。 ） 沸水浴10分鐘（誤差不超過1分鐘），轉(zhuǎn)至4C靜置6-8小時以保證充 分裂解。12, OOOrpm離心2分鐘，取上清液2ul做PCR反應(yīng)。另取陰陽 性質(zhì)控標準品各50ul加等量DNA提

5、取液打勻，沸水浴10分鐘后同上處 理。11.3GeneAmp5700操作取單管單人份 PCR反應(yīng)管若干管，直接加入處理后樣品（或陰陽性質(zhì)控標準品）2ul , 6000rpm離心數(shù)秒。將各反應(yīng)管放入 PCR儀，按下 列條件擴增：ABI GeneAmp570（的循環(huán)條件：93C 2分鐘預(yù)變性，然后按 93C 45秒55 C 60秒，先做10個循環(huán)，最后93 C 30秒55 C 45秒，做30 個循環(huán)。所有設(shè)置全部完成后保存文件，最后運行程序。11.4 結(jié)果分析條件的設(shè)定ABI GeneAmp5700的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根 據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) baseline 的 start 值

6、（24）,stop 值（79） 以及 Threshold 值, 使陰性質(zhì)控品 Ct 值為 30, 臨界陽性質(zhì)控標準品 Ct 值為 2224,強陽性質(zhì)控標準品 Ct值為1820,最后記錄儀器自動分析計算出 的 Ct 值.12 質(zhì)量控制程序：陰性質(zhì)控品：全部陰性 陽性定量標準品：全部陽性I r | 三 0.97（correlation 數(shù)值介于-0.97-1）; 108 至 104 基因拷貝/ml的陽性標準品檢測的定量值與理論值相比誤差小于土300%13 干擾： 標本污染。14 生物參考區(qū)間： 正常人樣本為陰性或 0 基因拷貝 /ml 。15. 患者檢驗結(jié)果的可報告區(qū)間：Ct值40,實驗樣本的CT DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml ） =M Ct值=40,樣品CT DNA含量25基因拷貝