茯苓多糖口服液藥效學(xué)試驗資料

1、茯苓多糖口服液產(chǎn)品資料茯苓多糖口服液藥效學(xué)試驗資料 茯苓是一種傳統(tǒng)中藥，又是名貴食用真菌。茯苓中含有豐富的 -茯苓聚糖，羧甲基茯苓多糖為-茯苓聚糖改造后的衍生物，我們將其制成茯苓多糖口服液（簡稱CMP口服液），對其進行了如下實驗研究。（一） 對免疫功能的影響1、 茯苓多糖口服液對免疫器官重量的影響2、 茯苓多糖口服液對抗體溶血素的影響3、 茯苓多糖口服液對巨噬細胞吞噬功能的影響4、 茯苓多糖口服液對天然殺傷細胞（NK細胞）活性的影響5、 茯苓多糖口服液對腫瘤壞死因子含量的影響6、 茯苓多糖口服液對白細胞介素-2(IL-2)活性的影響（二） 茯苓多糖口服液對腫瘤作用的實驗研究1、 對小鼠肉瘤18

2、0（S180）的抗癌作用2、 對小鼠愛氏腹水瘤（EAC）的抗癌作用實驗材料（一） 藥物：茯苓多糖口服液由本院中藥所資源室提供，批號930904 80mg/10ml/支，藥液濃縮至9.6mg/ml,給藥量為120mg，240mg/，相當于臨床用量的5、10 倍。（二） 動物：昆明種小鼠，1822g，雌雄各半，由湖南省衛(wèi)生防疫站動物實驗中心提供。昆明種小鼠，1819g，雌雄兼用，由同濟醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心提供。NIH純種小鼠，20±0.5g，雌雄兼用，同濟醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心提供。（三） 瘤株：愛氏腹水瘤（EACESC），S180由同濟醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究室提供。（四） 試劑：環(huán)磷酰胺：由上

3、海十二制藥廠生產(chǎn)（批號901202）使用當天用生理鹽水配成所需濃度75mg/kg，5-Fu：天津和平制藥廠生產(chǎn)（批號921004）。豚鼠血清：由湖南生物藥廠動物中心提供。SDS：（十二烷基硫化鈉）SICMA產(chǎn)品。實驗方法與結(jié)果（一） 對免疫功能的影響1、 對免疫器官重量的影響：將18-22g小鼠（雌雄兼用）隨機分為四組，每組12只動物。生理鹽水組和生理鹽水加環(huán)磷酰胺組，CMP口服液組分別按120mg，240mg/kg灌胃給藥，各組灌胃均為等效量體積，除生理鹽水組外，所有動物于第7天雞血紅細胞致敏，致敏前后各皮下注射環(huán)磷酰胺1次，連續(xù)給藥10天，次日放血，處死動物，稱取胸腺、脾臟重量。結(jié)果表明，

4、240mg/kg組與環(huán)磷酰胺組比較胸腺、脾臟重量明顯增加，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，有非常顯著性差異。（結(jié)果見表I） X 表：茯苓多糖口服液對小鼠免疫器官重量的影響（ ±SD）組別劑量（g/kg）動物數(shù)（n）體重（g）臟器系數(shù)（mg/10g）胸腺脾臟生理鹽水25ml1225.5±3.9874.01±18.69106.43±23.45生理鹽水+Cy25ml1224.63±2.3528.49±8.8164.58±27.93GMP口服液+Cy1201225.89±3.9329.30±7.0757.34±21.13

5、CMP口服液+Cy2401223.34±3.3742.91±8.09103.45±28.98 注：與生理鹽水組比“”P<0.001 與生理鹽水+Cy組比“”P<0.01，“”P<0.0012、 對抗體溶血素產(chǎn)生的影響 分組及給藥方法與實驗1相同。血清抗雞紅細胞溶血素抗體含量測定按中藥藥理實驗方法學(xué)“血清溶血素測定方法”進行。稀釋血清加雞紅細胞懸液及稀釋豚鼠血清，溫育分鐘后離心，比色測定光密度。以光密度讀數(shù)作為判定血清溶血素的指標，比較各組的差異。結(jié)果表明，茯苓多糖口服液240mg/kg組光密度值明顯升高，與NS+Cy組比，P<0.01有非常

6、顯著性差異。120mg/kg組與NS+Cy組比光密度略有升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。（見表）X 表：茯苓多糖口服液對抗體溶血素產(chǎn)生的影響（ ±SD）組別劑量mg/kg動物數(shù)nOD值生理鹽水25ml120.260±0.09NS+Cy25ml120.130±0.02CMP口服液+Cy120120.140±0.006CMP口服液+Cy240120.157±0.02 注：與生理鹽水組比：“” P<0.001 與NS+Cy組比：“” P<0.013、 對腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響：X分組及給藥方法同前，實驗前4天腹腔注射0.5%淀粉生理鹽水溶液，每

7、鼠0.5ml，實驗時按藥理實驗方法學(xué)中小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗方法進行。實驗時每鼠腹腔注射2%雞RBC懸液1ml，30分鐘后，處死動物，剪開腹部皮膚，經(jīng)腹膜注入NS 2ml，輕揉鼠腹部1分鐘，取腹腔液制片，4%（V/V）Giemsa磷酸緩沖液染色計數(shù)。X 表：茯苓多糖口服液對巨噬細胞吞噬功能的影響（ +SD）組別劑量mg/kg動物數(shù)n吞噬百分率吞噬指數(shù)生理鹽水25ml1267.75±8.721.93±0.52NS+Cy25ml1240.08±11.220.81±0.31CMP口服液+Cy1201250.42±10.091.01±0

8、.21CMP口服液+Cy2401257.67±11.631.51±0.52 注：與生理鹽水組比：“”P0.001 “”P0.05 與NS+Cy組比：“”P0.05 “”P0.01 “”P0.0014、 對NK細胞活性的影響 對正常動物NK細胞活性的影響選用20-22g昆明種小鼠，隨機分為三組，生理鹽水組，藥物茯苓多糖口服液組120、240ml/kg組給藥，各組均為等容量溶液灌胃給藥，連續(xù)給藥12天，末次給藥的次日處死動物測定NK細胞的活性。NK細胞活性采用“3H釋放法”。頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下制備脾細胞懸液，將細胞調(diào)至所需濃度，即為效應(yīng)細胞（E）懸液。取原制備的靶細胞

9、（T）懸液，E懸液各0.1ml加入96孔u型培養(yǎng)板中，E/T比取100：1，每個樣品設(shè)三個平行孔。用培養(yǎng)基代替效應(yīng)細胞作為自然釋放，用SDS代替效應(yīng)細胞作為最大釋放。培養(yǎng)板置CO2溫箱孵育18hr后，從各孔吸取0.1ml上清液置小塑管中，r計數(shù)器測CPM值。結(jié)果表明，給藥高、低劑量組的NK細胞活性均高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異。（見表）X表:茯苓多糖口服液對正常小鼠NK細胞活性的影響（ ±SD）組別劑量mg/kg動物數(shù)nNK細胞活性（%）生理鹽水25ml1155.67±19.13CMP口服液1201165.24±9.63CMP口服液2401267.02±7

10、.92 對荷瘤動物NK活性的影響取20±0.5gNIH純種小鼠40只，雌雄兼用。在每鼠右腋皮下接種EAC瘤細胞2×106個細胞。接種后第二天，隨機分為4組，每組10只動物，第1組為正常對照組，每只動物每日灌服0.6ml蒸餾水作陰性對照，第2組為5-Fu組，每日灌服15mg/kg作陽性對照，第3、4組為茯苓多糖口服液組，每日灌服劑量依次為100 200mg/kg。給藥8日后處死動物，在處死前2日，每日動物腹腔注射6%淀粉肉湯1ml，連續(xù)2天，處死動物后應(yīng)用LDH釋放法測定NK細胞活性。無菌取出小鼠脾臟，常規(guī)制備脾細胞懸液，最后用完全營養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×107/m

11、l。設(shè)NK試驗孔、自然釋放孔及最大釋放孔。用1%的NP-40破壞靶細胞作為最大釋放孔。按下表加樣于40孔培養(yǎng)板，每個標本設(shè)3個復(fù)孔。YAC-1細胞效應(yīng)細胞完全營養(yǎng)液1%NP-40NK試驗孔100ul100ul自然釋放孔100ul100ul100ul最大釋放孔100ul其中YAC-1細胞傳代培養(yǎng)2448hr，使用前經(jīng)洗滌后的完全營養(yǎng)液配成1×106/ml，效靶=100：1，效靶混合后，置37 5%CO2孵箱中培養(yǎng)16hr，然后各孔吸取上清液100ul置96孔培養(yǎng)板中，于37預(yù)溫，隨后每孔加入100ul LDH底物混合液，放室溫作用15分鐘，加終止反應(yīng)液后在490nm波長處用酶標檢測儀檢

12、測各孔的OD值。各孔NK活性值計算如下： 試驗孔OD值-自然釋入孔OD值NK活性%=× 最大釋放孔OD值-自然釋放孔后X實驗結(jié)果表明，服用茯苓多糖口服液劑量100200mg/kg后，能明顯增強荷瘤小鼠NK細胞活性。（見表）表V：茯苓多糖口服液對荷瘤小鼠NK活性的影響（ ±SD）組別劑量mg/kg動物數(shù)nNK細胞活性(%)t值P值陰性對照組1012.01±1.935-Fu組151016.01±2.583.88<0.01CMP口服液1001014.82±1.883.27<0.01CMP口服液2001015.56+3.442.82<

13、0.055、 對荷瘤動物腫瘤壞死因子含量的影響：荷瘤、分組及給藥方法與對荷瘤動物NK細胞活性的影響相同。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測腹腔M 中產(chǎn)生的TNF的含量。 小鼠腹腔M 中的腫瘤壞死因子（TNF）的誘生a) 小鼠處死前2日，每天腹腔注射6%淀粉肉湯1ml/每只鼠，連續(xù)2天。b) 處死小鼠，取腹腔中的M ，洗滌2次，用完全營養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2×106/ml。c) 取上述細胞懸液1ml，加入24孔細胞培養(yǎng)板中，貼壁2小時后用RPMI1640洗滌2次，加入終濃度為10ug/ml的LPS，培養(yǎng)16hr后，收集上清液。-20凍存?zhèn)溆谩?TNF含量的測定a) 包板：將抗TNF單抗

14、T和E6（濃度均為1mg/ml）分別取5ul加入1240ul包被緩沖液中，稀釋后二種抗體等量混合加入酶標板，每孔50ul，置4過液。b) 封閉：包被好的板經(jīng)洗滌后，加入封閉液（緩沖液）每孔100ul，37放置30分鐘。c) 封閉好的板洗滌后，加入按一定比例稀釋（8個梯度）的TNF標準品和待檢上清液，每孔50ul，置室溫1hr。d) 加一抗：反應(yīng)后的板經(jīng)洗滌后，加入1：100稀釋的兔抗TNF抗體，每孔50ul室溫反應(yīng)1小時。e) 加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體：上述反應(yīng)的板經(jīng)洗滌后加入1：100稀釋的酶標記抗體，每孔50ul，室溫反應(yīng)40-60分鐘，洗滌。f) 加底物OPD顯色：待等比釋孔顏色

15、梯度明顯時，用2NH2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)檢測儀各孔OD值。已知標準TNF含量與其相應(yīng)孔OD值呈線性關(guān)系。根據(jù)所得OD值，經(jīng)過相關(guān)分析，可得各待檢孔的相應(yīng)TNF的含量。結(jié)果表明，茯苓多糖口服液能使TNF含量增高。當劑量在200mg/kg時，荷瘤小鼠中的TNF含量與對照組相比明顯增高，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P<0.05。（見表）X表：茯苓多糖口服液對荷瘤小鼠TNF含量的影響（ ±SD）組別劑量mg/kg動物數(shù)nTNF含量（×105ug/ml）t值P值陰性對照組108.05±1.465-Fu組151012.28±4.033.11<0.05CMP口服液10

16、0108.50±2.530.48>0.05CMP口服液200109.69±1.422.52<0.056、 對正常動物白細胞介素-2（IL-2）活性的影響選用20-22g小鼠，隨機分為三組，對照組每天灌胃等容量生理鹽水，兩個給藥組分別按120mg/kg，240mg/kg灌胃羧甲基茯苓多糖口服液，連續(xù)給藥12天后，處死動物，無菌摘取脾臟，進行IL-2依賴細胞株（CTLL2）培養(yǎng)，CTLL2 細胞在培養(yǎng)基中于24孔板中傳代。然后再96孔板中稀釋標本，稀釋度為1：2、1：4、1：6、1：32、1：64，體積0.1ml，每一稀釋度2-3個復(fù)孔，將CTLL細胞從24孔板中吸

17、入離心管中，加RPMI-1640，200×10分鐘重復(fù)3次洗滌細胞，用含10%小牛血清RPMI-1640調(diào)整細胞濃度為1×105/ml，將調(diào)整好濃度的CTLL細胞加入到已稀釋標本的96孔板中，每空0.1ml，輕輕混勻，放到5% CO237培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17hr，加入8H-Tdr 0.5uci/孔，繼續(xù)培養(yǎng)6hr，用多頭細胞收集器收獲細胞，加入閃爍液，于Beckmen液閃儀上測cpm。以不同稀釋度IL-2標本cpm值作直線回歸，即用=a+b×公式計算IL-2活性單位，用t檢驗進行組間比較。X實驗結(jié)果表明，茯苓多糖口服液能明顯提高IL-2的活性，與對照組相比，有非常顯著

18、性差異。（見表）表：茯苓多糖口服液對小鼠IL-2活性的影響（ ±SD）組別劑量mg/kg動物數(shù)nIL-2（刺激指數(shù)）生理鹽水25ml1123.74±8.58茯苓多糖口服液1201144.03±8.26茯苓多糖口服液2401236.96±10.65注：與對照組相比：“”P<0.01，“”P<0.001（二） 抗腫瘤的實驗研究1、 對大鼠肉瘤S180的作用取S180菌株，以生理鹽水稀釋至0.2ml中含5×106 細胞數(shù)。接種到每只大鼠右前肢腋下，然后隨機分為5組，每組10只動物。第1組為陰性對照組，每天灌胃等容量NS，第2組為5-Fu陽

19、性對照組按20mg/kg灌胃5-Fu藥液；第3、4、5組為茯苓多糖口服組，分別按100、200、300mg/kg灌胃藥液在接種后24hr給藥，每天一次，按常規(guī)求出腫瘤抑制率。當抑制率>30%，P<0.05，動物死亡數(shù)<20%，動物體重下降率<15%時認為有效，結(jié)果見表。表：茯苓多糖口服液對S180瘤株的作用組別劑量mg/kg給藥途徑×療程（天）動物數(shù)（只）始/末-X體重變化率（%）瘤重（g）（ ±SD）抑制率（%）生理鹽水組25mlP0×810/1044.51.34±0.325-FU組20P0×810/1035.350.

20、54±0.4359.70茯苓多糖口服液100P0×810/1054.540.48±0.3464.17茯苓多糖口服液200P0×810/1045.580.70±0.3647.76茯苓多糖口服液300P0×810/1035.540.51±0.5361.94注：與對照組相比：“”P<0.05，“”P<0.01第一次重復(fù)試驗，分組，劑量，給藥時間均與上同，結(jié)果見表表：茯苓多糖口服液對S180瘤株的作用組別劑量mg/kg給藥途徑×療程（天）動物數(shù)（只）始/末-X體重變化率（%）瘤重（g）（ ±SD）抑制

21、率（%）生理鹽水組25mlP0×810/1032.51.30±0.225-FU組20P0×810/1021.980.67±0.1448.26茯苓多糖口服液100P0×810/1014.860.54±0.1258.61茯苓多糖口服液200P0×810/1037.410.78±0.1440.07茯苓多糖口服液300P0×810/1029.490.74±0.1643.08注：與對照組相比：“”P<0.05，“”P<0.01第二次重復(fù)試驗，分組，給藥時間均與上同。給藥組灌胃茯苓多糖口服液分別

22、為150、300mg/kg。陰性對照組，5-Fu陽性對照組給藥同前。結(jié)果見表。表：茯苓多糖口服液對S180瘤株的作用組別劑量mg/kg給藥途徑×療程（天）動物數(shù)（只）始/末-X體重變化率（%）瘤重（g）（ ±SD）抑制率（%）生理鹽水組25mlP0×810/1031.941.59±0.635-FU組20P0×810/10-1.00.375±0.2176.4茯苓多糖口服液150P0×810/1031.221.17±0.4726.7茯苓多糖口服液300P0×810/1039.31.15±0.2028

23、.0注：“”P<0.01，與對照組相比以上實驗表明：口服茯苓多糖口服液100300mg/kg 8天，對小鼠肉瘤S180的抑制率分別為64.17%40.07%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理均有顯著的抗癌作用。2、 對EAC腹水型瘤株的作用。荷瘤分組，給藥時間均與對S180瘤株的作用相同。給藥組分別按150mg、300mg/kg灌胃茯苓多糖口服液，陰性對照組給等體積生理鹽水，5-Fu陽性對照組按20mg/kg灌胃5-Fu藥液。結(jié)果見表。表：茯苓多糖口服液對EAC瘤株的作用組別劑量mg/kg給藥途徑×療程（天）動物數(shù)（只）始/末-X體重變化率（%）瘤重（g）（ ±SD）抑制率（%）生理鹽水

24、組25mlP0×810/1019.151.06±0.165-FU組20P0×810/1000.45±0.1657.45茯苓多糖口服液150P0×810/1015.50.43±0.1859.81茯苓多糖口服液300P0×810/1015.630.54±0.2149.06注：與對照組相比：“”P<0.05 “”P<0.01重復(fù)一次試驗，分組，給藥時間均與上同。給藥組分別按300mg/kg，600mg/kg灌胃口服液，陰性對照組及5-Fu陽性對照組給藥同前。結(jié)果見表表：茯苓多糖口服液對EAC瘤株的作用組別劑量

25、mg/kg給藥途徑×療程（天）動物數(shù)（只）始/末-X體重變化率（%）瘤重（g）（ ±SD）抑制率（%）生理鹽水組25mlP0×810/1014.411.02±0.155-FU組20P0×810/103.580.41±0.1959.80茯苓多糖口服液300P0×810/1015.610.62±0.2539.70茯苓多糖口服液600P0×810/10-8.80.51±0.2849.90注：與對照組比較 “”P<0.05，“”P<0.01以上實驗表明，口服茯苓多糖口服液150600mg/kg 8天，對EAC的抑制率分別為39.7059.81%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，具有明顯的抗癌作用。小結(jié)一、 環(huán)磷酰胺可使小鼠胸腺、脾臟的重量，產(chǎn)生溶血素的水平，巨噬細胞的吞噬能力明顯降低。在給環(huán)磷酰胺同時，給茯苓多糖口服液則可對抗環(huán)磷酰胺的抑制作用，可明顯提高小鼠胸腺