蛋白質(zhì)分子的特殊運(yùn)動――折疊.

1、蛋白質(zhì)分子的特殊運(yùn)動折疊分子生物學(xué)中心法則DNA / ” Q “TRANSCRIPTION蛋白質(zhì)折疊問題乂被稱為第二遙傳密昭§9蛋白質(zhì)的折疊給定一序列，它將怎樣折疊成其特定結(jié)構(gòu)?蛋白質(zhì)折疊研究的理論意義幾乎所有的生命活動都是由蛋白質(zhì)完成的而蛋白質(zhì)鏈只有折疊成天然結(jié)構(gòu)才有活性牛命從蛋白質(zhì)折疊開始!蛋白質(zhì)折疊研究的應(yīng)用意義蛋白質(zhì)工程的醫(yī)藥保健產(chǎn)品市場每年數(shù)十億美元已知二十多種疾病與蛋白質(zhì)的錯誤折疊有關(guān)（老年癡呆癥、瘋牛病等）蛋白質(zhì)折疊還是蛋白質(zhì)組研究的瓶頸之一Prion疾病myloidosis淀粉樣變性病Amyloid 淀粉狀蛋白 1854 Rudolph VirchowI有關(guān)蛋白質(zhì)折疊

2、的兒項(xiàng)車耍研究 1930s吳憲指出蛋白質(zhì)變性是肽鏈的構(gòu)象變化而非共價鍵變化> 1940s L. Pauling在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解出之前，根據(jù)物理化學(xué)原理預(yù)測了蛋白質(zhì)（X螺旋和0折迭結(jié)構(gòu)> 1960s C. Anfinsen 發(fā)現(xiàn)還原態(tài)RNase a,在除去還原劑和變性劑后能夠自動氧化恢復(fù)活性，提出蛋白質(zhì)的天 Nobel Prize, 1973 然結(jié)構(gòu)是其熱力學(xué)最穩(wěn)態(tài)A1960s人工合成牛胰島素 1. 2.有機(jī)溶劑 3,腺 4.鹽酸弧去垢劑溫度 pH 鹽 變性劑變性條件尿素：碳酸(全)酰胺o=C(NH2)28MM： HN=C(NH2)26M變性原理破壞次級鍵:不破壞共價鍵溫度：較高時

3、導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)聚沉，凝固，不可逆 pH :破壞鹽鍵，影響解離，改變相互作用的性質(zhì) 鹽:活度，溶解度腺:競爭氫鍵蛋白質(zhì)的功能決定于它們的天然構(gòu)象，因而過去 研究工作集中在蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象上，而對變性 態(tài)沒有給予足夠重視。近來，人們已知道蛋白質(zhì) 的非天然構(gòu)象至少在以下三方而有重要作用：1、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性2、蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸3、蛋白質(zhì)的水解和更新小分子蛋白質(zhì)去折疊轉(zhuǎn)變是可逆 的。在周圍環(huán)境的誘導(dǎo)下，小分 子蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊，當(dāng)將環(huán)境 刺激因素去掉后，去折疊的蛋白 質(zhì)又可以在折疊。廠RNARNAreplicationOTranslationPolyiMjptide? Second translat

4、ionProtein(active!GeneGene 2Gene 3Translation on the ribosome of RNA sequence into protein sequence and folding of proteinForniHtion of supra molecular complex:的提出蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)是由什么決定的？ 蛋白質(zhì)如何由一級結(jié)構(gòu)形成高級結(jié)構(gòu)? 如何由一級結(jié)構(gòu)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)？上述提法實(shí)際上要解決相同的問題分子內(nèi)、分子間的相互作用折疊過程中是否存在中間態(tài)絕大多數(shù)的小蛋白質(zhì)的去折疊與再折疊是 可逆的“一級結(jié)構(gòu)不僅為空間結(jié)構(gòu)編碼，而且以 某種方式規(guī)定指導(dǎo)

5、著達(dá)到這種空間結(jié)構(gòu)所經(jīng)歷 的途徑”蛋白質(zhì)折疊的密碼/立體化學(xué)密 碼/第二密碼。折疊密碼的復(fù)雜性：序列相近的蛋白取相 同的空間結(jié)構(gòu)；序列相同的肽段可以取不同的 二級結(jié)構(gòu)。兩個主要的考慮方向1熱力學(xué)條件:.2 .動力學(xué)條件化學(xué)反應(yīng)觀點(diǎn);相變觀點(diǎn)Christia n B. Anfin sen(1916-95)Anfinsen 對 Ribonuclease 的研究提出了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定高 級結(jié)構(gòu)的假說。Anfinsen's work, 1957-63: formation of native disulfide bonds in ribonuclease A and other protei

6、ns.Key discovery: the information needed for folding is contained in the amino acid sequence.二、蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)考慮Anfinsen的經(jīng)典熱力學(xué)假說：Anfinsen認(rèn)為天然蛋白質(zhì)多肽鏈所采取的構(gòu)象 是在一定環(huán)境條件下（如溶液組分、pH、溫度、 離子強(qiáng)度等），整個系統(tǒng)的總Gibbs自止I能取最低, 所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈能夠在這樣的環(huán)境下自 發(fā)折疊成天然構(gòu)象。Anfinsen 實(shí)驗(yàn)變性蛋白的復(fù)性實(shí)驗(yàn):.從二硫鍵入手，提出假設(shè)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其正確性: 材料：牛胰核糖核酸酶含4對二硫鍵 26-84 58-

7、11040-9565-72SS交聯(lián)方式:7x5x3x1 = 105種，天然只占其中一種Fig. I The amino acid sequence of bovine j>ancreatic ribonuclease (50).w、S'SS®®SN'c、3> 90'2V°G'Z、* ' * w v's，A，n，p，H 7 p'PNG,-7C 0Jt - rl'八50Figure 2-50Amino «i< i<l M <|urn<<- of lM&g

8、t;inr i iImh nuclease. I br lour diMilfidc bonclx arc shown in color. (After <I.H.W.Iliis. S. M<H>r< an<l W.ll. Slcin /. “/ Uirm. 2S5(l9ti<>):<i3：i.JHjN牛胰核糖核酸酚Anfinsen 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?:模型2：模型3：空間障礙，只允許一種構(gòu)象（二硫鍵配對） 生物合成的結(jié)果先形成了熱力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象，然后形成二硫鍵加固實(shí)驗(yàn)否定了前兩種假設(shè)，肯定了第三種Anfinsen 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一：1. 腺變性。RNAase

9、+ 8M服+疏基乙醇 腺使得肽鏈展開，酶失活2. 透析除腺和疏基乙醇，疏基乙醇pH-8弱堿性條件，溶液暴露于空氣中, 重新氧化復(fù)性，酶活力重新獲得 Beta-Mercaptoethanol:2ch2 hch2ch3hoch2ch2shhoch2ch2shHOCH2CH2Shoch2ch2s+ h2orSH酵素hoch2ch?sh hoch2ch2shOxidized proteins IsS SSHMixed disulfideSHSHReduced proteinFigure 2-51Reduction of the (Hsulf ulc bonds in a protein by an e

10、xcess of a sniniydryl reagent (R-SH) such as -nevra)UyeihiiuA.過量毓基乙醇 導(dǎo)致還原腺變性Anfinsen 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二I. 脈變性。RNAase + 8M嫌+毓基乙醇 腺使得肽鏈展開，酶失活2. 透析除毓基乙醇，然后通02,再透析除脈結(jié)果：酶活性恢復(fù)到-0.01u(r95Native stftto; ' catnblicully active.406811040124addition MAnd mefraplo- eltmnolUnfolded BtAU*； inactive DUuiftdo cross-linkw red

11、uced to yield Cys rtwiduee.ScrambledlibonucleaseTr>c« of“mercsptoethanolVNativeremAvnl of urea and mcrca|4n- ethanolNative % catalytically ttctivc DiHulAde cros«-hnk» of the four cystine residues correctly reformed.rbonucleoseFigure 2-54Formal ion vf native i ilx>n uclcaM* f rom

12、 'U'ramblcd rilMiniiclriusc- in the prrs- enrr <»l a tr;ux* o! /<-incH；i|)tc>cthan(>l.Anfinsen 實(shí)驗(yàn)錯恥的二 硫鍵只: 要加一丿 點(diǎn)毓基 醇就可: 性1. 由實(shí)驗(yàn)可知，模型2 （生物介成的結(jié)果） 不成立，因?yàn)殡x體條件下復(fù)性的蛋白具有全部 酶活性（后來又有實(shí)驗(yàn)證明體外解折疊是完全 的，全人工合成）2. 由實(shí)驗(yàn)二可知，模型1 （空間障礙，只允許 一種構(gòu)象（二硫鍵配對）不成立，否則，復(fù) 性的蛋白應(yīng)該具有兒乎全部酶活性3. 模型3 （先形成了熱力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象，然

13、后形 成二硫鍵加固）能夠解釋both結(jié)果。結(jié)論：蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定三級結(jié)構(gòu) 形成三級結(jié)構(gòu)所需要的所有信息包含在一級結(jié)構(gòu)中。Anfinsen 實(shí)驗(yàn)Model 1Anfinsen實(shí)驗(yàn)的啟示：and 2 都有實(shí)驗(yàn)支 1.成功需要一點(diǎn)點(diǎn)運(yùn)氣（簡單的單結(jié)構(gòu)域蛋白）扌#2. 抓住主要矛盾，善于洞察問題的本質(zhì)3. 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐评聿皇堑玫秸_結(jié)論的必要條件正確的前提+正確的推導(dǎo)=正確的結(jié)論 正確的前提+錯誤的推導(dǎo)=正確或錯誤的結(jié)論 錯誤的前提+正確的推導(dǎo)=錯誤的結(jié)論（大概率） 錯誤的前提+錯誤的推導(dǎo)=正確或錯誤的結(jié)論同時代取得的其它一些結(jié)果折疊是以結(jié)構(gòu)域?yàn)閱挝贿M(jìn)行的。ribonuclease A去除5 C末端殘基

14、后，蛋白質(zhì)就喪失了正確 形成二硫鍵的能力。（H. Taniuchi, J. Biol. Chem. 245, 5459- 5468; 1970）含有兩個或多個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，相鄰結(jié)構(gòu)域的解折疊是 近似相互獨(dú)立的Levinthal Paradox對一個100個氨基酸殘基的小蛋白質(zhì)鏈假設(shè)：只有主鏈二面角e和屮可以轉(zhuǎn)動每個一面角只有3個可能值貝歸總構(gòu)象數(shù)為阱00:如果：每轉(zhuǎn)動一次時間為105秒貝U：歷遍所有構(gòu)象約需IO?年而:宇宙年齡為1-5x1O10三、折疊的動力學(xué)考慮:有無中間體？最低自由能構(gòu)象能否達(dá)到?:折疊過程是怎樣的？兩態(tài)折疊520o. SQgoE pepounouonma單一結(jié)構(gòu)域的蛋白

15、質(zhì)，不存在平衡中間態(tài)。1020304050Temperature (°C)折疊中間態(tài)的發(fā)現(xiàn)首先在折疊、去折疊的早期動力學(xué)時(快速反應(yīng)) 中發(fā)現(xiàn)。(Cytochrome c: A. Ikai and C. Tanford, Nature 230, 100-102; 1971; ribonuclease A: T. Y. Tsong, R.L. Baldwin and E.L. Elson, PNAS 6& 2712-2715; 1971)折疊中間態(tài)?Fig. 1 Comparison of ExperirnGntai M©thod3 for Delect»o

16、n of Fast Protein Folding Reactions and ThwTimo-Scales.Fig. 1 Comparison of ExperirnGntai M©thod3 for Delect»on of Fast Protein Folding Reactions and ThwTimo-Scales.coulpE3 Bep%二 s?23o0-23.04.05.06.0(OEPZUO Bap 60匸【0】快速檢測蛋白質(zhì)折疊的方法924 O. and 1. KiefhaberFig. 1 Comparison of ExperirnGntai M&#

17、169;thod3 for Delect»on of Fast Protein Folding Reactions and ThwTimo-Scales.Fig. 1 Comparison of ExperirnGntai M©thod3 for Delect»on of Fast Protein Folding Reactions and ThwTimo-Scales.slopped-flowpressure jumpcontinuous-flowFig. 1 Comparison of ExperirnGntai M©thod3 for Delect

18、»on of Fast Protein Folding Reactions and ThwTimo-Scales.Fig. 1 Comparison of ExperirnGntai M©thod3 for Delect»on of Fast Protein Folding Reactions and ThwTimo-Scales.NMR relaxationFig. 1 Comparison of ExperirnGntai M©thod3 for Delect»on of Fast Protein Folding Reactions and

19、 ThwTimo-Scales.ultrasonic absorptionlaser flash photolysisr T-jumpW9 10" w5 10*3101101103Time (s)Fig. 1 Comparison of ExperirnGntai M©thod3 for Delect»on of Fast Protein Folding Reactions and ThwTimo-Scales.通過二硫鍵捕捉中間體捕獲二硫鍵j蠶白質(zhì)折疊過程的時間尺度109 107 10® 103 10 1 101 103lime (s)TirTMi-S

20、caias for Formation oi Structural Elements in Protein Folding.The data were taken from 0幀 航19991 (1). (Hagen 1996) (2). (Gruenewald1979： Thompson etaf 1997) (3), iMuoz etaf.1997) <4).af. 1996: Shastry and Roder, 1998)(5). (Jaencke, 1999)(6).平均每個Aa可以有10種構(gòu)象，lOOAa的多肽鏈 有10皿種可能的構(gòu)象。從一個構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋€構(gòu) 彖所需最短時間

21、1O-'3S,則該蛋白嘗試所有的構(gòu)彖 的時間是10«5 s= 1077y,而人們觀察到蛋白質(zhì)體內(nèi)、 體外折疊的時間是10103s.結(jié)論：蛋白質(zhì)的折疊不是隨機(jī)嘗試所有可能的 構(gòu)象直到遇到某個白山能最低的構(gòu)象，而是沿著某 些確定的途徑進(jìn)行的。蛋白質(zhì)的夭然構(gòu)彖未必是最 低口由能的構(gòu)象，而是動力學(xué)途徑中所能得到的穩(wěn) 定的構(gòu)象。Levinthal Paradox偏制疊中合象試 量限折程不構(gòu)嘗能移了過對理的Fig. 1. Mean first-passage time, in years, as a function of th energy bias U/kT.對蛋白折疊過程的共識兩種過程成核：小蛋白多步：大蛋白，以結(jié)構(gòu)域?yàn)閱挝坏鞍踪|(zhì)折疊的啟動疏水塌縮經(jīng)熔球中間態(tài)(molten globul