LUMINEX技術原理及應用

1、Luminex的基本原理及應用傳統(tǒng)的蛋白質分析主要采用雙抗體夾心ELISA法。此法長期以來被視為蛋白質定量分析的“標準方法”。ELISA可以用來準確測定大批量生物樣品，但每次實驗只能分析一個目標分子，而不具備同時分析多種目標分子的能力。在ELISA基礎上發(fā)展出的 luminex技術，不僅同樣通過雙抗體選擇而具有高特異性，同時也具有ELISA的高通量、操作簡便、測量準確等優(yōu)點，而且可以在一次實驗中完成對多種目標分子的分析，從而改變了過去的分析模式，建立了更加高效快速的分析平臺。Luminex技術原理，在近年發(fā)表的文章中已有過詳細的介紹和說明。Luminex 技術應用微球和流式細胞儀的原理。 微球

2、內部含有三種熒光免疫熒光，通過熒光不同的比例可以區(qū)分500種不同的微球。每種微球可以用來檢測一種不同的蛋白或基因。 因此，利用微球技術，可以同時檢測高達500個蛋白或基因。該技術利用熒光編碼的微球共價交聯(lián)單克隆抗體，與被測定的目標分子結合后，加入熒光素標記的檢測抗體，再通過激光掃描熒光編碼來識別單個微球和測量“檢測熒光”強度來確定被測分子的濃度。在使用相同抗體對的條件下，luminex技術的測量結果在準確度、精確度、靈敏度方面與ELISA均可達到相似的水平。Luminex應用的熒光編碼微球帶有針對不同目標分子的特異性抗體，不同的微球在一定程度上可以自由組合，這樣在一次實驗中可以同時完成多個目標

3、分子的分析。多目標分子的同時測定可以大大減少生物樣品的消耗量，節(jié)省成本和測定時間，并且使多種目標分子之間相關性的分析更加準確。很多公司已經開始提供Luminex試劑盒，用于基礎和臨床醫(yī)學研究以及臨床檢測。目前，Luminex試劑盒已經可以檢測500多種蛋白質分子，包括細胞因子、激素、自身抗體、腫瘤標志物等。Luminex常見問題及解答LUMINEX應用于哪些領域?生物醫(yī)學研究，生物標記物開發(fā)，臨床檢測等領域。Luminex技術主要用于蛋白和核酸檢測分析。LUMINEX敏感性如何？靈敏度取決于開頭的質量。對于同樣的抗體對，Luminex檢測的靈敏度高于ELISA技術。一般檢測靈敏度在pg級。對不

4、同類型的樣品制備和樣品量的要求是怎樣的？血清、血漿是常用的樣本，每次檢測需要10ul， 每次可以檢測多個蛋白。從各種細胞或組織中提取的蛋白也可以用Luminex技術檢測，制備方法與ELISA、Western Blot完全一樣。一般可以檢測到多少基因或蛋白的表達信息？檢測蛋白和基因的數目主要取決于試劑盒。 蛋白質檢測目前最高可以達到50個左右，基因檢測最高達500個。如何保證檢測結果的特異性？檢測的特異性取決于抗體高特異性。 試劑幾乎全部來源于美國大公司，產品經過了嚴格的質量控制。同時，我們檢測公司也有近15年的經驗、嚴格的操作程序和質量控制體系?？蛻糇约禾峁┛贵w，是否可以進行LUMINEX檢測

5、？Luminex和ELISA檢測試劑都需要兩個配套的特異性抗體。我們公司具有開發(fā)Luminex試劑盒的經驗。但是，需要一系列的開發(fā)工作才能保證結果的特異性、重復性和可靠性。除了蛋白，LUMINEX技術是否還可以用于其它指標的檢測？可以用于基因表達，基因多態(tài)性和HLA配型分析。檢測周期多久？視待測蛋白的種類、數量和標本數量定。一般來說，檢測一組蛋白（1-50個，視蛋白種類定）和一組標本（多達360個標）需要3-4小時的操作時間及基本數據分析。但是，檢測周期也取決于公司當時的工作量。一般來說，從標本收到起，檢測應在1-2周完成；但是部分蛋白試劑盒需要收到訂單后從美國進口，檢測周期可能會延長到4-5

6、周。如何判定 LUMINEX數據表達水平差異有無意義？表達差異主要取決于標本的性質和數量，我們公司為客戶提供專業(yè)的數據統(tǒng)計服務。LUMINEX實驗和流式細胞儀的優(yōu)劣比較? Luminex技術是流式細胞儀和微球相結合的蛋白、核酸檢測技術， 檢測對象是蛋白質、DNA等大分子。普通流式細胞儀主要用于檢測整體細胞表面或細胞內的蛋白表達情況。Luminex檢測蛋白和標本數目大，是一種高通量檢測技術。普通流式細胞儀每次只能檢測幾種蛋白分子，而且檢測速度較慢，不適合高通量分析。 由此可見，兩種方法應用方向有很大差別。報告的格式如何？報告以xcel表格形式，包括每種蛋白在每個標本中的表達量。公司也可以為客戶提

7、供數理統(tǒng)計分析結果。完成一個LUMINEX的實驗,需要的細胞的量是多少? 至少10ul的血清、血漿，蛋白提取物， 或50-100萬細胞。如何控制LUMINEX檢測的質量？我們對每一次檢測都設定標準曲線，并設定內參進行校正。我們會定期做儀器校正，檢測精密度和重復性實驗以確保檢測結果的可靠性。實驗失敗有幾種原因? 從實驗室角度看，成敗原因包括試劑盒的質量，待測樣品稀釋倍數；待測蛋白質低于儀器檢測底限，實驗操作程序。從客戶角度看，成敗取決于樣品制備，保存和運輸是否恰當。我們公司可以提供規(guī)范操作程序，供客戶參考。得到實驗的結果后, 可以進行那些研究的工作? 可進行多方面的研究，例如：觀察不同實驗條件對

8、待測蛋白含量的影響，可進行藥物作用靶點研究，不同人群血樣生物標記物的研究，健康評估，疾病診斷，指導治療等。經過分析后，若得到幾百個感興趣的基因或蛋白，如何對這些基因做功能分類或者Pathway相關分析呢？分析方法與其它技術平臺一樣，我們公司可以提供全套有償服務。如何考慮LUMINEX重復實驗的問題？我們每次都會對使用的標準品和內參做重復性測定，同時也建議對每份樣本進行重復2次測定。在進行LUMINEX實驗時，由于經費的限制，是否可以把多個樣品進行混合以消除樣品的個體差異后再上LUMINEX檢測？不建議這么做。多個樣品做檢測，計算平均值和誤差才有統(tǒng)計學意義。如果多個樣品混合后測定只能算1份樣品。

9、客戶是組織的樣品，準備自己提取樣品，請問樣品提取方面有沒什么技術要求？需要采用對抗原抗體反應，或者蛋白質抗原性沒有抑制作用的提取液進行提取，避免采用會造成蛋白質變性的試劑，如高濃度的尿素或者鹽酸胍等。需要能完全提取待測蛋白質，否則對結果會造成誤判。提取以后需要怎么保存，怎么運輸？建議保存于-80度。避免反復凍融?？捎酶杀蛘咧辽儆帽\輸。LUMINEX的假陽性率是多少? 技術性的假陽性率非常低，小于1%。生物假陽性率取決于每個蛋白的生物學特征?？砷_展此項目的臨床科室有哪些？目前我公司擁有的世界最先進的高通量液相芯片檢測技術，在國內僅有3臺。是否可以將同一癥狀的病例混合后抽提,看共性表達?可以

10、?；旌虾蟮臉悠穼⒈灰曌鲉我粯悠愤M行檢測。服務流程如何？幫助客戶制定檢測方案樣品檢測結果分析報告出具可為客戶提供更深層次的服務（實驗設計、數據分析、論文撰寫與發(fā)表）如何訂購您們的服務？通過咨詢，協(xié)商檢測方案，然后付費或簽訂合同。 LUMINEX蛋白檢測平臺服務項目一、細胞因子、化學因子類：6Ckine/CCL2BCA-1/CXCL13CTACK/CCL27皮膚T細胞虜獲趨化因子EGF表皮生長因子ENA-78/CXCL5 中性粒細胞激活蛋白-78Eotaxin 嗜酸細胞活化趨化因子Eotaxin-2/CCL24/MPIF-2嗜酸細胞活化趨化因子-2Eotaxin-3/CCL26嗜酸細胞活化趨化因子

11、-3FGF-2 成纖維細胞生長因子-2Flt-3 ligand FMS樣酪氨酸激酶3 配體Fractalkine 人神經趨化因子GCP2/CXCL6 人中性粒細胞趨化蛋白2G-CSF 粒系集落刺激因子GM-CSF 粒-單系集落刺激因子GRO生長相關基因蛋白HCC-1/3/CCL14/I-309/CCL1IFN2干擾素2IFN干擾素IL-10白介素-10IL-11白介素-11IL-12 (p40) 白介素-12IL-12 (p70) 白介素-12IL-13白介素-13IL-15白介素-15IL-16白介素-16IL-17白介素-17IL-1ra白介素-1raIL-1白介素1IL-1白介素-1IL

12、-2白介素-2IL-20 白介素-20IL-21 白介素-21IL-23 白介素-23IL-28a 白介素-28aIL-29 白介素-29IL-3白介素-3IL-33/NF-HEV (mature) 白介素-33IL-4 白介素-4IL-5 白介素-5IL-6 白介素-6IL-7 白介素-7IL-8 白介素-8IL-9 白介素-9IP-10 干擾素誘導蛋白-10I-TAC/CXCL11干擾素誘導T細胞趨化因子LIF白血病抑制因子Lymphotactin淋巴細胞趨化蛋白MCP-1(MCAF)單核細胞趨化蛋白1MCP-2單核細胞趨化蛋白2MCP-3/CCL7單核細胞趨化蛋白3MCP-4單核細胞趨化

13、蛋白4M-CSF巨噬細胞集落刺激因子MDC/CCL22 巨噬細胞來源的趨化因子MIG/CXCL9趨化因子9MIP-1D (MIP-5/CCL15)巨噬細胞炎性蛋白-1DMIP-1巨噬細胞炎性蛋白-1MIP-1巨噬細胞炎性蛋白-1MIP-3/CCL19巨噬細胞炎性蛋白3MIP-3/CCL20巨噬細胞炎性蛋白3MMP -1基質金屬蛋白酶-1MMP -2 基質金屬蛋白酶-2MMP -3 基質金屬蛋白酶-3MMP -7 基質金屬蛋白酶-7MMP -9 基質金屬蛋白酶-9MMP -10 基質金屬蛋白酶-10MMP -12 基質金屬蛋白酶-12MMP -13 基質金屬蛋白酶-13NAP-2/CXCL7中性

14、粒細胞趨化蛋白2PDGF-AA 血小板衍生生長因子AAPDGF-AB/BB血小板衍生生長因子AB/BBRANTES分泌趨化因子sCD30 可溶性CD30sCD40L可溶性CD40LSCF干細胞因子SDF-1+/CXCL12基質細胞衍生因子-1+sEGFR可溶性表皮生長因子受體sgp130 可溶性糖蛋白130sIL-1RI可溶性白細胞介素-1受體IsIL-1RII可溶性白細胞介素-1受體IIsIL-2R可溶性白細胞介素-2受體sIL-4R可溶性白細胞介素-4受體sIL-6R 可溶性白細胞介素-6受體sRAGE 可溶性晚期糖基化中產物受體sTNF RI 可溶性腫瘤壞死因子受體IsTNF RII可溶

15、性腫瘤壞死因子受體IIsVEGF R2 可溶性血管內皮生長因子受體2sVEGF R3 可溶性血管內皮生長因子受體3sVEGF RI 可溶性血管內皮生長因子受體ITARC/CCL17胸腺活化調節(jié)趨化因子TGF轉化生長因子TIMP-1組織金屬蛋白酶抑制劑-1TIMP-2組織金屬蛋白酶抑制劑-2TIMP-3組織金屬蛋白酶抑制劑-3TIMP-4組織金屬蛋白酶抑制劑-4TNF 腫瘤壞死因子TNF腫瘤壞死因子TPO 甲狀腺過氧化物酶TRAIL/TNFSF10TSLP人胸腺基質淋巴細胞生產素VEGF血管內皮生長因子二、細胞信號通路類：Active Caspase 3 活化半胱胺酸蛋白酶 3Active Cl

16、eaved PARP活化切割的多腺苷二磷酸多聚酶Akt/PKB (Ser473) 磷酸化蛋白激酶BAkt/PKB (Thr308) 磷酸化蛋白激酶BATF2 (Thr69/71)活化復制因子2BAD (Ser112)CD3 (pan Tyr)c-Jun (Ser73)c-Kit (pan Tyr)Cleaved PARPc-Met/HGFR (pan Tyr)CREB (Ser133)EGF Receptor (pan Tyr)表皮生長因子受體Erb-B2/HER2 (pan Tyr)第二人體表皮生長因子受體ERK/MAP Kinase 1/2 (Thr185/Tyr187)GAPDHH2A.

17、X (Ser139)HSP27 (Ser 78)IGF1R (pan Tyr)胰島素樣生長因子1受體IRS1 (pan Tyr)IB (Ser 32)JNK (Thr183/Tyr185)LAT (pan Tyr)Lck (pan Tyr)MEK1 (Ser222)MKK6 (Ser207/Thr211)MSK1 (Ser212)p21p38 (Thr180/Tyr182)p53 (Ser15)p53 (Ser46)p70 S6 Kinase (Thr412)PDGF Receptor (pan Tyr)Rsk1 (Ser380)STAT1 (Tyr701)STAT1 (Tyr707)STAT

18、2 (Tyr690)STAT3 (Ser727)STAT3 (Tyr705)STAT5A/B (Tyr694/699)STAT6 (Tyr641)Syk (pan Tyr)ZAP-70 (pan Tyr)三、神經因子類：CortisolApo AlApo CIIIApo EBDNFCathepsin D組織蛋白酶DComplement C3Complement C4Complement Factor HC reactive protein (CRP) C-反應蛋白MelatoninMIP-4MPONCAMNeurotensinOrexin AOxytocinPAI-1 (total)PDGF-

19、AAPDGF-AB/BBPEDFPrealbuminRANTESSAPsICAM-1Substance PsVCAM-11-Antitrypsin2-Macroglobulin-MSH-Endorphin四、骨代謝因子類：RANKLAdiponectin脂聯(lián)素IL-1ACTHIL-6InsulinLeptin瘦素Osteopontin (OPN)骨橋蛋白OsteocalcinOsteoprotegerinPTHTNF 腫瘤壞死因子五、皮膚生長調控因子：CortisolFibronectinHSAInvolucrinLPSKeratin-6Keratin - 1Keratin - 10六、凋亡及

20、敗血癥因子：MIF巨噬細胞移動抑制因子PAI-1 (Total)sFassFasLsICAM-1sVCAM-1七、免疫球蛋白分型：IgAIgG1IgG2IgG3IgG4IgM八、腫瘤生物標記物：CA-125癌抗原125IGF-II 胰島素樣生長因子2Leptin瘦素MIF巨噬細胞移動抑制因子Osteopontin (OPN)骨橋蛋白Prolactin泌乳刺激素MMP-1基質金屬蛋白酶-1MMP-2 基質金屬蛋白酶-2MMP-9基質金屬蛋白酶-9CA 15-3癌抗原檢測15-3Serum amyloid A血清淀粉樣蛋白ACA 19-9癌抗原19-9TGF 轉化生長因子Cathepsin D組織

21、蛋白酶DTNF 腫瘤壞死因子VEGF血管內皮生長因子VEGFR2血管內皮生長因子受體2-2-Microglobulin -2微球蛋白CEA 癌胚抗原C reactive protein (CRP) C-反應蛋白E-cadherin 上皮型鈣黏附蛋白EGFR表皮生長因子受體Eotaxin 嗜酸細胞活化趨化因子ER- 雌激素受體Fas(CD95 or Apo-1) 腫瘤壞死因子受體超家族成員6Ferritin 鐵蛋白Fibrinogen纖維蛋白原AFP 甲胎蛋白Follistatin 卵泡素G-CSF 集落刺激因子3Haptoglobin 結合珠蛋白HER-2(erbB2) 第二人體表皮生長因子受

22、體ICAM-1細胞間粘附分子-1IGFBP-1胰島素樣生長因子結合蛋白1IGFBP-2胰島素樣生長因子結合蛋白2IGFBP-3胰島素樣生長因子結合蛋白3Angiopoietin-2血管生成素2LH賴氨酸羥化酶MCP-1(MCAF)單核細胞趨化蛋白1MIG/CXCL9趨化因子9tPSA總前列腺特異性抗原fPSA游離前列腺特異性抗原NSE神經元特異性烯醇化酶Free-hCG游離血清人絨毛膜促性腺激素EB antibody EB病毒抗體HE4人附睪分泌蛋白4CA215癌抗原215CA242癌抗原242CA724癌抗原724CA50癌抗原50Cyfra 21-1角蛋白19片段SCCA鱗狀細胞癌抗原九、內分泌激素類：ACTHAGRPAmylin (Active or Total)BDNFCNTFC-PeptideFSHGHGLP-1 (Active)GlucagonIGF-1IGFBP-1胰島素樣生長因子結合蛋白1IGFBP-2胰島素樣生長因子結合蛋白2IGFBP-3胰島素樣生長因子結合蛋白3IGFBP-4胰島素樣生長因子結合蛋白4IGFBP-5胰島素樣生長因子結合蛋白5IGFBP-6IGFBP-7InsulinLeptinLH賴氨酸羥化酶Prolactin泌乳刺激素TSHGhrelin (Active)GIP (Tota