DIG應(yīng)用小帖士

1、DIG應(yīng)用小帖士： DNA的標(biāo)記和檢測(cè)（Southern Blotting）如果用以探針合成的DNA的模板的數(shù)量比較少或者質(zhì)量不夠高的時(shí)候，建議您使用PCR DIGProbe Synthesis Kit。該試劑盒是專用于制備高靈敏度的雜交探針，例如單拷貝的基因。其另一個(gè)特點(diǎn)就是無(wú)需之間的定量斑點(diǎn)檢測(cè)過(guò)程，通過(guò)定量凝膠電泳就可以快速確定PCR標(biāo)記探針的效率。    如果您手上有足夠數(shù)量的高純度模板，就建議您使用采用隨機(jī)引物標(biāo)記方法的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kits I 和II。這兩

2、個(gè)試劑盒包含了標(biāo)記，封閉，雜交和檢測(cè)所需要的所有試劑，是真正意義上的一站式服務(wù)的試劑盒，提供您DIG標(biāo)記和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)需要的所有產(chǎn)品。它們之間的差別在于檢測(cè)方法的不同：Starter Kits I采用了顯色法，使用LE NBT/BCIP；而Starter Kits II選用化學(xué)發(fā)光法底物CSPD。詳細(xì)的DNA雜交探針標(biāo)記方法，可參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DIG Application Manual for Filter Hybridization 88頁(yè)。RNA 的標(biāo)記和檢測(cè)（Northern Blotting）    在Northern blotting中即可以使用DNA探

3、針，也可以使用RNA探針。通常，RNA探針的特異性和靈敏度度都會(huì)更高一些；當(dāng)然如果對(duì)靈敏度和特異性沒有特別嚴(yán)格的要求的話，DNA探針會(huì)更方便操作。    如果您需要制備RNA探針的話，推薦您使用Northern Starter Kit。該試劑盒以線性的DNA為模板，通過(guò)SP6, T7或是T3 RNA聚合酶的作用將DIG-11-UTP摻入到轉(zhuǎn)錄的RNA中，借助化學(xué)發(fā)光底物CDP-Star檢測(cè)。另一個(gè)產(chǎn)品DIG RNA Labeling Kit也可用于RNA探針的標(biāo)記。想了解詳細(xì)的RNA探針的使用及完整的Northern Blot操作過(guò)程，參考可參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DI

4、G Application Manual for Filter Hybridization 98頁(yè)。標(biāo)記探針的定量     盡管DIG系統(tǒng)的靈敏度很高，為了獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)記探針和模板的用量是很重要的。同樣在每次標(biāo)記實(shí)驗(yàn)后，通過(guò)spot test檢測(cè)探針的標(biāo)記效率也是非常重要的，可用以準(zhǔn)確計(jì)算雜交實(shí)驗(yàn)中的探針用量。雜交實(shí)驗(yàn)中探針用量的不準(zhǔn)帶來(lái)的影響是顯而易見的：探針的用量太多會(huì)帶來(lái)太多的背景問題，而探針的用量過(guò)少，則又會(huì)導(dǎo)致雜交信號(hào)太弱。Table 1中列出了一般雜交式樣中建議使用的DIG標(biāo)記探針的使用量。DIG系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)就在于：DIG PCR探針的產(chǎn)量可以

5、通過(guò)凝膠電泳的方式來(lái)定量。RNA 探針則可以檢測(cè)到探針的完整性。關(guān)于詳細(xì)的探針標(biāo)記效率直接測(cè)定的方法請(qǐng)參閱相應(yīng)的產(chǎn)品說(shuō)明書以及可參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DIG Application Manual for Filter Hybridization 79頁(yè)。雜交溫度雜交條件的優(yōu)化取決于雜交片段的類型以及GC含量。RNA-RNA和RNA-DNA間的雜交溫度就要比DNA-DNA間的高。總體來(lái)說(shuō)，不同片段間的雜交作用力RNA-RNA>RNA-DNA>DNA-DNA。因此做為一個(gè)通常的規(guī)律，以40GC含量的哺乳動(dòng)物目的片段為例，在DIG Easy Hyb (DIG系統(tǒng)專用，無(wú)毒，絕對(duì)不含DNase

6、、RNase和任何的污染物) 或是50甲酰胺存在環(huán)境下的雜交溫度分別是：è DNA-DNA: 3742è DNA-RNA: 50è RNA-RNA: 68靶核酸的膠上樣量由于DIG系統(tǒng)的高靈敏度的特點(diǎn)，靶核酸的膠上樣量要小于其他的系統(tǒng)（Table 2）。同時(shí)DIG系統(tǒng)匹配的陽(yáng)離子的尼龍膜也為DIG標(biāo)記的雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)提供了最強(qiáng)的信號(hào)和最低的背景影響。檢測(cè)方法對(duì)于探針和靶序列間形成的雜交子的檢測(cè)通常使用堿性磷酸酶耦聯(lián)的抗體，采用顯色或化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)（table 3）。在眾多的堿性磷酸酶的底物中，我們推薦使用CDP-Star或CSPD用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，NBT/BCIP用

7、于顯色反應(yīng)。此外對(duì)于膜雜交中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)，建議使用Lumi-Film以獲得最理想的信號(hào)。詳細(xì)的操作過(guò)程，請(qǐng)參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DIG Application Manual for Filter Hybridization110或119頁(yè)。此外對(duì)于膜雜交中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)，建議使用Lumi-Film以獲得最理想的信號(hào)。探針的撥離和重探詳細(xì)的操作過(guò)程，請(qǐng)參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DIG Application Manual for Filter Hybridization127頁(yè)。檢測(cè)底物è即用型CDP-Star堿性磷酸酶作用于CDP-Star底物，產(chǎn)生的光信號(hào)被X膠片曝光或是圖像設(shè)備

8、采集。與CSPD相比較，CDP-Star的主要特點(diǎn)在于由于光信號(hào)產(chǎn)生的速度更快（10倍于CSPD）同時(shí)強(qiáng)度更強(qiáng)，可大量縮短曝光時(shí)間。其信號(hào)的釋放可以持續(xù)大概兩天的時(shí)間，因此可以進(jìn)行多次曝光?；瘜W(xué)發(fā)光的底物僅僅適用于尼龍膜。è即用型CSPD堿性磷酸酶作用于CSPD底物，產(chǎn)生的光信號(hào)可被X膠片（例如：Lumi-Film）或是圖像設(shè)備采集。由于其同樣具有持續(xù)的發(fā)光過(guò)程，因此也可以進(jìn)行多次曝光。在尼龍膜上使用CSPD或CDP-Star底物的雜交，還可進(jìn)行探針的剝離和重探。èNBT/BCIP使用類似NBT/BCIP顯色底物的好處就在于，檢測(cè)的過(guò)程中不再需要X膠片，既可以使用尼龍膜也可

9、以是使用硝酸纖維素膜。然而，如果想要獲得高靈敏度的檢測(cè)結(jié)果，可能就需要較長(zhǎng)的時(shí)間了（幾個(gè)小時(shí)）。這種方法也有其不足之處：首先通過(guò)這種方法只能一次性獲得信號(hào)，不能多次檢測(cè)；在探針剝離前，需要使用二甲基甲酰胺先將膜上沉淀的顏色去除。è其他的底物和抗體在整個(gè)DIG系統(tǒng)中，還有其他的一些底物和多種熒光抗體，例如Fast Red Tablets, BM Purple, HNPPFluorescent Detection Set)和DAB POD Substrate ；供不同研究的需要。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與放射性探針標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)的比較：第一，放射性探針的檢測(cè)時(shí)間需要18h，而DIG標(biāo)記系統(tǒng)的檢測(cè)時(shí)間僅需要15min；第二，使用DIG 標(biāo)記的探針在panel B上檢測(cè)到的兩