真菌殺滅試驗(yàn)

1、真菌殺滅試驗(yàn)2.1.1.9.1 目的在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測定消毒劑殺滅懸液中或載體上真菌繁殖體或真菌孢子 所需劑量，以驗(yàn)證對真菌及其孢子實(shí)用消毒劑量。2.1.1.9.2 試驗(yàn)器材（1）麥芽浸膏瓊脂（MEA :見附錄A。（2）沙堡瓊脂培養(yǎng)基：見附錄 A。（3）試驗(yàn)菌及其菌懸液或菌片的制備白色念珠菌 ATCC 10231 和黑曲霉菌 ATCC 1 6404或孢子懸液與菌片 按 2.1.1.9.3（1） 和 2.1.1.9.3（2） 所示方法制備。此外，根據(jù)消毒劑特定用途和特殊需要，可選用其它真菌或 孢子懸液與菌片。（ 4）中和劑 （根據(jù) 2.1.1.5 所示方法鑒定合格者 ）。（ 5）磷酸鹽緩沖液 （ PB

2、S， 0.03 mol/L ，pH7.2） 。（6）消毒劑稀釋用硬水:見附錄 A。（7）有機(jī)干擾物質(zhì):見附錄 A。（ 8）刻度吸管 （0.1ml 、 1 .0ml 、5.0ml） 。（ 9）恒溫水浴箱。（ 10）噴霧裝置（用于噴霧消毒試驗(yàn)）。（ 11 ）電動混合器。（ 12）計(jì)時裝置。2.1.1.9.3 真菌懸液制備（1）白色念珠菌懸液的制備1）取凍干菌種管，以無菌操作打開，用毛細(xì)吸管吸加適量沙堡液體培養(yǎng)基于管中，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0ml 10.0ml 沙堡液體培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置37C培養(yǎng)18h24h。用接種環(huán)取第 1 代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于沙堡瓊脂培養(yǎng)基

3、平板 上，于37C培養(yǎng)18h24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落， 接種于沙堡瓊脂斜面，于37C培養(yǎng)18h24h,即為第3代培養(yǎng)物。 將其密封后在4C保存，時間不得超過6周。2）試驗(yàn)時，取第 3 代斜面培養(yǎng)物在砂堡瓊脂斜面上連續(xù)傳代，方法 與第 3 代相同。取第 5 代或 6 代的沙堡瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18h24h）,用5.0 ml吸管吸取3.0ml5.0ml稀釋液加入斜面 試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用 5.0ml 吸管將洗液移至另 一無菌試管中，用電動混合器混合 20s，或在手掌上振敲80次，以 使白色念珠菌菌懸浮均勻。3） 懸液殺菌試驗(yàn)時，實(shí)驗(yàn)用菌懸液的含菌量為1O07c

4、fu/ml5X 107cfu/ml ;菌片制備按2.1.1.2 要求進(jìn)行。4）菌懸液保存在4C冰箱內(nèi)備用。當(dāng)天使用不得過夜。5）懷疑有污染時，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒 定。菌落形態(tài)可直接用顯微鏡觀察。 菌體形態(tài)可在涂片后直接用高倍 顯微鏡觀察，也可用墨水陰地法染色（將菌與黑墨水在玻片上混勻， 推成薄膜）后觀察。2）黑曲霉 ATCC 16404 懸液或菌片的制備。1） 取凍干菌種管，以無菌操作打開，用毛細(xì)管吸取少量麥芽浸膏肉 湯培養(yǎng)基加到菌種管中，輕輕吹吸，使菌種沉淀物融化分散。取少許 沉淀物懸液加到含 5.0ml 麥芽浸膏營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，置 30C 士 1C培養(yǎng)42h4

5、8h。用接種環(huán)劃線接種第1代培養(yǎng)物于MEA培 養(yǎng)基平板，置30C 士 1C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h48h。取平板培養(yǎng)物中 的典型菌落，接種于麥芽浸膏營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基， 置30C 士 1C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h48h,即為第3代培養(yǎng)物。將其密封后在4C保存， 時間不得超過 9 周。2）試驗(yàn)時，取第3代斜面培養(yǎng)物接種麥芽浸膏瓊脂斜面，30C培養(yǎng) 48h，取得3.05.0ml麥芽浸膏肉湯，洗下斜面上的培養(yǎng)物，接種羅 氏瓶，并搖動使菌液布滿 MEA 培養(yǎng)基表面，然后吸棄多余肉湯培養(yǎng) 物液體，置 30C 士 1C 培養(yǎng)7d9d。3）向羅氏瓶培養(yǎng)物中加入 5.0 ml10.0ml 0.05% （V/V）吐溫80

6、生 理鹽水溶液， 刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中， 將孢子懸液移入裝有玻 璃珠的三角瓶中，輕輕振搖 1min 后，濾過除去菌絲。濾過后，顯微 鏡下（400 倍）觀察是否存在菌絲， 若懸液中有菌絲存在， 可經(jīng) 5000 r/min6000 r/min ,離心20min。再次在顯微鏡下（400倍）觀察， 若懸液中仍有菌絲存在，須再離心。4）黑曲霉分生孢子懸液在 2C8C儲存不能超過2 d，使用前， 混合均勻，在顯微鏡下（ 400 倍）觀察是否有孢子出芽，若有孢子出 芽，則棄之不用。5) 使用時，可用稀釋液適當(dāng)稀釋。懸液試驗(yàn)時實(shí)驗(yàn)用菌懸液的含菌 量為 1 x 107 cfu/ml 5X 107 cfu/

7、ml。6) 制備染菌樣片時染菌方法為滴染法，每片加菌懸液 10卩l(xiāng)。染菌 后，置37C培養(yǎng)箱內(nèi)干燥(約30min),或置室溫下自然陰干后再使 用。7) 回收菌數(shù)應(yīng)達(dá)5x 105cfu/片5x 106cfu/片，可依試驗(yàn)要求確定。2.1.1.9.4 試驗(yàn)分組試驗(yàn)分為下列各組 :(1) 試驗(yàn)組，按 2.1.1.7.3 規(guī)定，選定消毒劑濃度與作用時間，對受 試菌種的殺滅能力進(jìn)行測定。(2) 陽性對照組， 以硬水代替消毒劑溶液， 按 2.1.1.7.3 規(guī)定程序進(jìn) 行試驗(yàn)。所得結(jié)果代表試驗(yàn)體系中所含試驗(yàn)菌的初始濃度， 并以其計(jì) 算消毒因子對試驗(yàn)菌的殺滅對數(shù)值。(3) 陰性對照組，觀察同次試驗(yàn)用相關(guān)溶液

8、和培養(yǎng)基有無污染。2.1.1.9.5 試驗(yàn)程序常用殺滅試驗(yàn)有：懸液定量殺菌試驗(yàn)、載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)、載體 噴霧定量殺菌試驗(yàn)等。 培養(yǎng)基對白色念珠菌為沙堡葡萄糖瓊脂， 對黑 曲霉菌為麥芽浸膏瓊脂(MEA。其操作程序詳見。活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)時，對白色念珠菌，在 37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h觀察最 終結(jié)果。對黑曲霉菌，在30C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。2.1.1.9.6 評價規(guī)定(1) 產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)，按產(chǎn)品使用說明書指定的使用濃度和作用時間， 重復(fù)試驗(yàn) 3 次 ，對白色念珠菌和黑曲霉菌各次試驗(yàn)的殺滅對數(shù)值均> 4.00,要求載體定量殺滅試驗(yàn)，各次試驗(yàn)的殺滅對數(shù)值均3.00 ,可判定該產(chǎn)品對真菌污染物消毒合格。(2) 產(chǎn)品申報(bào)衛(wèi)生許可檢驗(yàn), 按產(chǎn)品使用說明書指定的使用濃度和 3 個作用時間, 重復(fù)試驗(yàn) 3 次,要求懸液定量殺滅試驗(yàn)在產(chǎn)品使用說明 書規(guī)定使用濃度與最短作用時間, 以及最短作用時間的 1.5 倍時,各 次試驗(yàn)的殺滅對數(shù)值均應(yīng)4.00 ,在產(chǎn)品使用說明書規(guī)定使用濃度與 最低作用時間的0.5倍時，允許殺滅對數(shù)值V 4.00,可判為實(shí)驗(yàn)室試 驗(yàn)該產(chǎn)品對真菌污染物消毒的有效劑量。用載體浸泡定量殺滅試驗(yàn)評價殺菌效果時, 在產(chǎn)品使用說明書規(guī)定使 用濃度與最短作用時間, 以及最短作用時間的 1.5 倍時,各次