《微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

1、微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書楊翔華 主編遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院第一部分 實(shí)驗(yàn)?zāi)康奈⑸飳W(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)課是我院環(huán)境科學(xué)專業(yè)學(xué)生必修的一門重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課，是學(xué)生進(jìn)入我院實(shí)驗(yàn)室的第一門實(shí)驗(yàn)課。微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的目的是使學(xué)生掌握微生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，正確的使用實(shí)驗(yàn)的儀器設(shè)備，在學(xué)生頭腦中建立無菌概念和掌握無菌操作技能是最重要的內(nèi)容，是學(xué)生進(jìn)行后續(xù)課實(shí)驗(yàn)和研究的基礎(chǔ)。在目前的實(shí)驗(yàn)室條件和有限學(xué)時(shí)的情況下，得到微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本操作和技能訓(xùn)練，培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手操作能力和創(chuàng)新能力。通過微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)，加深理解和鞏固課堂所學(xué)的知識(shí)，熟悉微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作技術(shù)，了解微生物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)知識(shí)。

2、通過微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析問題、解決問題的能力，養(yǎng)成實(shí)事求是、嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度、創(chuàng)新精神、創(chuàng)新思維和創(chuàng)新能力。本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書主要內(nèi)容包括：微生物個(gè)體和菌落形態(tài)觀察、染色方法、培養(yǎng)基制備和滅菌、無菌操作、微生物檢測和分離、生理生化反應(yīng)、影響微生物生長的因素和污染物微生物降解實(shí)驗(yàn)，水中微生物分布調(diào)查等內(nèi)容。同時(shí)也注意和環(huán)境微生物學(xué)的聯(lián)系與區(qū)別。整個(gè)實(shí)驗(yàn)課中貫穿了顯微鏡使用滅菌方法無菌操作微生物菌種分離篩選鑒定、選育微生物代謝作用這一主線。微生物學(xué)需掌握的基本操作在實(shí)驗(yàn)中得到訓(xùn)練，同時(shí)加深了學(xué)生對(duì)所學(xué)微生物學(xué)基本概念的理解。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)貼近生活，可以大大提高同學(xué)們學(xué)習(xí)微生物學(xué)的興趣。實(shí)驗(yàn)內(nèi)

3、容與目錄如下：序 號(hào)實(shí)驗(yàn)名稱學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)類型實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡的使用及活性污泥中生物相的觀察3基礎(chǔ)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二微生物的染色及觀察3實(shí)驗(yàn)三培養(yǎng)基的制備和滅菌3實(shí)驗(yàn)四純種微生物的分離、轉(zhuǎn)種和培養(yǎng)3實(shí)驗(yàn)五有機(jī)污染物質(zhì)的生物降解實(shí)驗(yàn)*4綜合性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)六雙歧桿菌口服液的發(fā)酵制備*4*注：實(shí)驗(yàn)六為選做實(shí)驗(yàn)。第二部分 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的對(duì)象大多為環(huán)境微生物，其中某些微生物對(duì)人體具有危害性，因此要求進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后必須嚴(yán)格遵守以下實(shí)驗(yàn)室規(guī)則：1.進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)先穿白大衣，離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)要脫下白大衣，反折放回原處，不必要的物品不得帶入實(shí)驗(yàn)室，必須帶入的書籍和文具等應(yīng)放在指定的非操作區(qū)，以免受到污染。無菌操作時(shí)

4、必須戴口罩，并不得開電風(fēng)扇。2進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先洗手，避免手上的分秘物、食物油、護(hù)膚用品和沾染的微生物等對(duì)實(shí)驗(yàn)造成污染。3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止飲食、抽煙，不得高聲說笑或亂走亂串。4各種實(shí)驗(yàn)物品應(yīng)按指定地點(diǎn)存放，用過的器材必須經(jīng)消毒處理，禁止隨意放置。5須送恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)的物品，應(yīng)做好標(biāo)記（標(biāo)明姓名、編號(hào)、日期、培養(yǎng)時(shí)間）后送到指定地點(diǎn)。6實(shí)驗(yàn)過程中如發(fā)生意外事故時(shí)，禁止隱瞞或自作主張不按規(guī)定處理，應(yīng)立即報(bào)告老師進(jìn)行正確的處理。如有傳染性、腐蝕性的材料污染桌面、地面等，應(yīng)立即用0.2%-0.5% “84”消毒液浸泡污染部位，作用510min后方可抹去。如手被活菌污染也應(yīng)使用上述消毒液浸泡510

5、min或肥皂清洗后，再以自來水反復(fù)沖洗干凈，必要時(shí)去醫(yī)院就醫(yī)。7愛護(hù)室內(nèi)儀器設(shè)備，嚴(yán)格按操作規(guī)則使用。節(jié)約使用實(shí)驗(yàn)材料，不慎損壞了器材等，應(yīng)主動(dòng)報(bào)告老師進(jìn)行處理。8實(shí)驗(yàn)完畢，應(yīng)物歸原處、將臺(tái)面整理清潔，將實(shí)驗(yàn)室打掃干凈。最后以肥皂洗手后方可離開實(shí)驗(yàn)室。第三部分 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一 光學(xué)顯微鏡的使用及活性污泥中生物相的觀察實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：基礎(chǔ)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：3學(xué)時(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?#160;   1. 學(xué)習(xí)并掌握顯微鏡的原理和使用方法。 2. 復(fù)習(xí)普通臺(tái)式顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分的功能和使用方法。 3. 觀察幾種真核微生物的個(gè)體形態(tài)，掌握生物圖的

6、繪制方法。二、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)及油鏡的工作原理 現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常被稱為復(fù)式顯微鏡，它們由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學(xué)顯微鏡通常配置的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)最大，對(duì)微生物學(xué)研究最為重要。與其他物鏡相比，油鏡的使用比較特殊，需在載玻片與鏡頭之間滴加鏡油，這主要有如下二方面的原因： 1. 增加照明亮度 油鏡的放大倍數(shù)可達(dá)100×，放大倍數(shù)這樣大的鏡頭，焦距很短，直徑很小，但所需要的光照強(qiáng)度卻最大。從承載標(biāo)本的玻片透過來的光線，因介質(zhì)密度不同（從玻片進(jìn)入空氣

7、，再進(jìn)入鏡頭），有些光線會(huì)因折射或全反射，不能進(jìn)入鏡頭，致使在使用油鏡時(shí)會(huì)因射入的光線較少，物像顯現(xiàn)不清。所以為了不使通過的光線有所損失，在使用油鏡時(shí)須在油鏡與玻片之間加入與玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油鏡（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。2. 增加顯微鏡的分辨率 顯微鏡的分辨率或分辨力是指顯微鏡能辨別兩點(diǎn)之間的最小距離的能力。從物理學(xué)角度看，光學(xué)顯微鏡的分辨率受光的干涉現(xiàn)象及所用物鏡性能的限制，分辨力D可表示為：D=/2NA，式中= 光波波長； NA= 物鏡的數(shù)值孔徑值。 ），而數(shù)值孔徑值則取決于物鏡的鏡口角和玻片與鏡頭間介質(zhì)的折射率，可表示為：NA=n×sin式中左

8、右。利用顯微鏡的放大原理觀察視野中的各種生物，根據(jù)觀察到的生物形態(tài)、運(yùn)動(dòng)方式、生物（細(xì)胞）結(jié)構(gòu)初步判斷所觀察到的生物的種類。三、實(shí)驗(yàn)器材 1. 菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）染色玻片標(biāo)本、青霉（Penicillium sp.）的水封片等（教師可根據(jù)具體情況選用菌種）、活性污泥混合液。2. 溶液或試劑：香柏油、乙醇：乙醚混合液 3. 儀器或其他用具：顯微鏡、擦鏡紙等。 四、操作步驟 1. 觀察前的準(zhǔn)備 （1） 顯微鏡的安置：置顯微鏡于平整的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣約3-4cm 。鏡檢時(shí)姿勢要端正。 取放顯微鏡時(shí)應(yīng)一手握住鏡臂，一手托住底座，使顯微鏡保持直立、平穩(wěn)。切忌

9、用單手拎提；且不論使用單筒顯微鏡或雙筒顯微鏡均應(yīng)雙眼同時(shí)睜開觀察，以減少眼睛疲勞，也便于邊觀察邊繪圖或記錄。（2） 光源調(diào)節(jié)：安裝在鏡座內(nèi)的光源燈可通過調(diào)節(jié)電壓以獲得適當(dāng)?shù)恼彰髁炼?，而使用反光鏡采集自然光或燈光作為照明光源時(shí)，應(yīng)根據(jù)光源的強(qiáng)度及所用物鏡的放大倍數(shù)選用凹面或凸面反光鏡并調(diào)節(jié)其角度，使視野內(nèi)的光線均勻，亮度適宜。 （3）根據(jù)使用者的個(gè)人情況，調(diào)節(jié)雙筒顯微鏡的目鏡，雙筒顯微鏡的目鏡間距可以適當(dāng)調(diào)節(jié)，而左目鏡上一般還配有曲光度調(diào)節(jié)環(huán)，可以適應(yīng)眼距不同或兩眼視力有差異的不同觀察者。 （4） 聚光器數(shù)值孔徑值的調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)聚光器虹彩光圈值與物鏡的數(shù)值孔徑值相符或略低。有些顯微鏡的聚光器只標(biāo)有

10、最大數(shù)值孔徑值，而沒有具體的光圈數(shù)刻度。使用這種顯微鏡時(shí)可在樣品聚焦后取下一目鏡，從鏡筒中一邊看著視野，一邊縮放光圈，調(diào)整光圈的邊緣與物鏡邊緣黑圈相切或略小于其邊緣。因?yàn)楦魑镧R的數(shù)值孔徑值不同，所以每轉(zhuǎn)換一次物鏡都應(yīng)進(jìn)行這種調(diào)節(jié)。在聚光器的數(shù)值孔徑值確定后，若需改變光照強(qiáng)度，可通過升降聚光器或改變光源的亮度來實(shí)現(xiàn)，原則上不應(yīng)再通過虹彩光圈調(diào)節(jié)。當(dāng)然，有關(guān)虹彩光圈、聚光器高度及照明光源強(qiáng)度的使用原則也不是固定不變的，只要能獲得良好的觀察效果，有時(shí)也可根據(jù)不同的具體情況靈活運(yùn)用，不一定拘泥不變。 2. 顯微觀察 在目鏡保持不變的情況下，使用不同放大倍數(shù)的物鏡所能達(dá)到的分辨率及放大率都是不同的。一般

11、情況下，特別是初學(xué)者，進(jìn)行顯微觀察時(shí)應(yīng)遵守從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀察程序，因?yàn)榈捅稊?shù)物鏡視野相對(duì)大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)及確定檢查的位置。 低倍鏡觀察：金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本玻片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推進(jìn)器使觀察對(duì)象處在物鏡的正下方。下降 10×物鏡，使其接近標(biāo)本，用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，使標(biāo)本在視野中初步聚焦，再使用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至圖像清晰。通過玻片夾推進(jìn)器慢慢移動(dòng)玻片，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。 在任何時(shí)候使用粗調(diào)節(jié)器聚焦物像時(shí)，必需養(yǎng)成先從側(cè)面注視小心調(diào)節(jié)物鏡靠近標(biāo)本，然后用目鏡觀察，慢慢調(diào)節(jié)物鏡離開標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)焦的習(xí)慣，以免因一時(shí)的誤

12、操作而損壞鏡頭及玻片。 高倍鏡觀察：低倍鏡下找到合適的觀察目標(biāo)并將其移至視野中心后，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移至工作位置。對(duì)聚光器光圈及視野亮度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)后微調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器使物像清晰，利用推進(jìn)器移動(dòng)標(biāo)本仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。在一般情況下，當(dāng)物像在一種物鏡中已清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器將其他物鏡轉(zhuǎn)到工作位置進(jìn)行觀察時(shí)，物像將保持基本準(zhǔn)焦的狀態(tài)，這種現(xiàn)象稱為物鏡的同焦 (parfocal) 。利用這種同焦現(xiàn)象，可以保證在使用高倍鏡或油鏡等放大倍數(shù)高、工作距離短的物鏡時(shí)僅用細(xì)調(diào)節(jié)器即可對(duì)物像清晰聚焦，從而避免由于使用粗調(diào)節(jié)器時(shí)可能的誤操作而損壞鏡頭或載玻片。 油鏡觀察：高倍鏡或低倍鏡下找到要

13、觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升高，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域加滴香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標(biāo)本相接。將聚光器升至最高位置并開足光圈，若所用聚光器的數(shù)值孔徑值超過1.0，還應(yīng)在聚光鏡與載玻片之間也加滴香柏油，保證其達(dá)到最大的效能。調(diào)節(jié)照明使視野亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現(xiàn)物像并用細(xì)調(diào)節(jié)器使其清晰準(zhǔn)焦為止。 有時(shí)按上述操作還找不到目的物，則可能是由于油鏡頭下降還未到位，或因油鏡上升太快，以至眼睛捕捉不到一閃而過的物像。遇此情況，應(yīng)重新操作。另外應(yīng)特別注意不要因在下降鏡頭時(shí)用力過猛，或調(diào)焦時(shí)誤將粗調(diào)節(jié)器向反方向

14、轉(zhuǎn)動(dòng)而損壞鏡頭及載玻片。 （4）活性污泥觀察 取一片干凈的載玻片放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用一支滴管吸取試管中藻類培養(yǎng)液于載玻片的中央，用干凈的蓋玻片覆蓋在液滴上(注意不要有氣泡)即成標(biāo)本片。用低倍鏡和高倍鏡觀察。3. 顯微鏡用畢后的處理 （1） 上升鏡筒，取下載玻片。 （2） 用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸取少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。 （3） 用擦鏡紙清潔其他物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。 （4） 將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，再向下旋。同時(shí)把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)。

15、 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 1.分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌及青霉的形態(tài)，包括在三種情況下視野中的變化。同時(shí)注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。2.繪出活性污泥生物相觀察中和各種微生物和菌膠團(tuán)。六、思考題 1、用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問題？在載玻片和鏡頭之間加滴什么油？起什么作用？ 2、試列表比較低倍鏡、高倍鏡及油鏡各方面的差異。為什么在使用高倍鏡及油鏡時(shí)應(yīng)特別注意避免粗調(diào)節(jié)器的誤操作？ 3、什么是物鏡的同焦現(xiàn)象？它在顯微鏡觀察中有什么意義？ 4、影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？ 5、根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會(huì)，談?wù)剳?yīng)如何根據(jù)所觀察微生物的大小，選擇不同的物鏡進(jìn)行有效的觀察。 6、

16、根據(jù)你觀察到的活性污泥中的微生物種類，說明水質(zhì)污泥情況。實(shí)驗(yàn)二 微生物的染色及觀察實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：基礎(chǔ)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：3學(xué)時(shí)一、細(xì)菌的簡單染色法 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)。  掌握細(xì)菌的簡單染色法。  初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征，鞏固學(xué)習(xí)油鏡的使用方法和無菌操作技術(shù)。 2 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色。利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)

17、。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。常用堿性染料進(jìn)行簡單染色，這是因?yàn)樵谥行?、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。常用作簡單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。 當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時(shí)可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。 染色前必須固定細(xì)菌。其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對(duì)染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)盡量維持細(xì)胞原有的形

18、態(tài)。 3 材料   菌種 枯草芽孢桿菌1218h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、大腸桿菌24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、面包酵母瓊脂斜面培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)教師可根據(jù)具體情況提供合適的菌種。  染色劑 呂氏堿性美藍(lán)染液(或草酸銨結(jié)晶紫染液)，石炭酸復(fù)紅染液。   儀器或其他用具 顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，玻片擱架、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)，擦鏡紙，生理鹽水或蒸餾水等。 4 流程 涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢。 5 步驟   涂片 取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌

19、的條件下各滴一小滴生理鹽水(或蒸餾水)于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作，分別從枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和大腸桿菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。若用菌懸液(或液體培養(yǎng)物)涂片，可用接種環(huán)挑取23環(huán)直接涂于載玻片上。注意滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時(shí)不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。   干燥 室溫自然干燥。也可以將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。但切勿離火焰太近，因溫度太高會(huì)破壞菌體形態(tài)。  固定 如用加熱干燥，固定與干燥合為一步，方法同干燥。  涂片、干燥和熱固定。  染色 將玻片平放于玻片擱架上，

20、滴加染液12滴于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍(lán)染色12min，石炭酸復(fù)紅(或草酸銨結(jié)晶紫)染色約1min 。   水洗   干燥 甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風(fēng)吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。   鏡檢 涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。 6 結(jié)果 繪制單染色后觀察到的大腸桿菌和藤黃微球菌的形態(tài)圖。 二、革蘭氏染色法 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。 學(xué)習(xí)掌握革蘭氏染色技術(shù)，鞏固學(xué)習(xí)光學(xué)顯微鏡油鏡的使用方

21、法。 2 實(shí)驗(yàn)原理 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain Gram氏創(chuàng)立的，革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實(shí)際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、

22、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。 3 材料   菌種 大腸桿菌（Escherichia  coli）約24h營養(yǎng)瓊脂斜面菌種一支，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）約16h牛肉膏瓊脂

23、斜面菌種一支。   染色劑 結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅液。  儀器或其他用具 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、蒸餾水、香柏油、二甲苯。 4 流程 涂片干燥固定染色（初染媒染脫色復(fù)染）鏡檢。 5  步驟   涂片   常規(guī)涂片法 取一潔凈的載玻片，用特種筆在載玻片的左右兩側(cè)標(biāo)上菌號(hào)，并在兩端各滴一小滴蒸餾水，以無菌接種環(huán)分別挑取少量菌體涂片，干燥、固定。玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。   初染 滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)于兩個(gè)玻

24、片的涂面上，染色12min ，傾去染色液，細(xì)水沖洗至洗出液為無色，將載玻片上水甩凈。   媒染用盧戈氏碘液媒染約l min ，水洗。   脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，立即水洗，終止脫色，將載玻片上水甩凈。 革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。脫色時(shí)間一般約2030s。   復(fù)染 在涂片上滴加番紅液復(fù)染約23min ，水洗，然后用吸

25、水紙吸干。在染色的過程中，不可使染液干涸。   鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。  實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處理 清潔顯微鏡。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，涼干后備用。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.根據(jù)觀察結(jié)果，繪出兩種細(xì)菌的形態(tài)圖。 2.列表簡述兩株細(xì)菌的染色結(jié)果(菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應(yīng))。 四、思考題1. 哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭色染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)

26、節(jié)是什么？ 2. 進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，為什么特別強(qiáng)調(diào)菌齡不能太老，用老齡細(xì)菌染色會(huì)出現(xiàn)什么問題? 3. 革蘭氏染色時(shí)，初染前能加碘液嗎?乙醇脫色后復(fù)染之前，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色? 4. 不經(jīng)過復(fù)染這一步，能否區(qū)別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌？ 5. 你認(rèn)為制備細(xì)菌染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)該注意哪些環(huán)節(jié)? 6. 為什么要求制片完全干燥后才能用油鏡觀察? 7. 如果涂片未經(jīng)熱固定，將會(huì)出現(xiàn)什么問題?加熱溫度過高、時(shí)間太長，又會(huì)怎樣呢? 實(shí)驗(yàn)三 培養(yǎng)基的制備和滅菌實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：基礎(chǔ)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：3學(xué)時(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.

27、了解并掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法；2.掌握各種實(shí)驗(yàn)室滅菌方法及技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98100下融化，于45以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底

28、滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。三、實(shí)驗(yàn)材料 1、器皿及材料 天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報(bào)紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。 2、藥品試劑  蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計(jì)、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。 3、流程 稱藥品溶解調(diào)pH值融化瓊脂過濾分裝包扎標(biāo)記滅菌擺斜面或倒平板。

29、 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1 培養(yǎng)基的制備   稱量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。   溶解 用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補(bǔ)足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補(bǔ)足水分。   調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測定pH可用pH

30、試紙或酸度計(jì)等。   溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補(bǔ)足水分(水需預(yù)熱)。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。   過濾分裝 分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞， 引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。   包扎標(biāo)記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，制

31、備組別和姓名、日期等。   滅菌 上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為12120min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。 倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到4550,立刻倒平板。2 滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本實(shí)驗(yàn)主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。 加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內(nèi) 蛋白質(zhì)凝固

32、變性，從而達(dá)到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，可增加滅菌效力。 濕熱滅菌 煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸。對(duì)于細(xì)菌的營養(yǎng)體煮沸約1530min，對(duì)于芽孢則需煮沸約12h。 高壓蒸汽滅菌法：高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到/cm2時(shí)，水蒸氣的溫度升高到121，經(jīng)153

33、0min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。 操作方法和注意事項(xiàng) 加水：打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。立式消毒鍋?zhàn)詈糜靡阎箝_過的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。 裝料、加蓋：滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對(duì)角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。 排氣：打開排氣口(也叫放氣閥)。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當(dāng)有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈。 升壓、保壓和降壓：當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。當(dāng)壓力上升

34、至所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開始計(jì)算滅菌時(shí)間，待時(shí)間達(dá)到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時(shí)，打開放氣閥。注意不能過早過急地排氣，否則會(huì)由于瓶內(nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外。 滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)：滅菌后的培養(yǎng)基放于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)24h培養(yǎng)無菌生長，可保存?zhèn)溆茫恍泵媾囵B(yǎng)基取出后，立即擺成斜面后空白培養(yǎng)；半固體的培養(yǎng)基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后，空白培養(yǎng)。 干熱滅菌法 通過使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160170維持12h。 干熱滅菌法常

35、用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。 滅菌前的準(zhǔn)備 玻璃器皿等在滅菌前必須經(jīng)正確包裹和加塞，以保證玻璃器皿于滅菌后不被外界雜菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用紙包扎或裝在金屬平皿筒內(nèi)；三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙，用棉繩以活結(jié)扎緊，以防滅菌后瓶口被外部雜菌所污染；吸管以拉直的曲別針一端放在棉花的中心，輕輕捅入管口，松緊必須適中，管口外露的棉花纖維統(tǒng)一通過火焰燒去，滅菌時(shí)將吸管裝入金屬管筒內(nèi)進(jìn)行滅菌，也可用紙條斜著從吸管尖端包起，逐步向上卷，頭端的紙卷捏扁并擰幾下，再將包好的吸管集中滅菌。   干燥箱滅菌 將

36、包扎好的物品放入干燥烘箱內(nèi)，注意不要擺放太密，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內(nèi)層底板直接接觸。將烘箱的溫度升至160170并恒溫12h，注意勿使溫度過高，超過170，器皿外包裹的紙張、棉花會(huì)被烤焦燃燒。如果是為了烤干玻璃器皿，溫度為120持續(xù)30分鐘即可。溫度降至6070時(shí)方可打開箱門，取出物品，否則玻璃器皿會(huì)因驟冷而爆裂。 用此法滅菌時(shí)，絕不能用油、蠟紙包扎物品。   火焰滅菌 直接用火焰灼燒滅菌，迅速徹底。對(duì)于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。此外，在接種過程中，試管或三角瓶口，也采用通過火焰而達(dá)到滅菌的目的。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、

37、記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度、壓力等）。 2、試述高壓蒸汽滅菌的過程及注意事項(xiàng)。 六、思考題 1、制備培養(yǎng)基的一般程序是什么？ 2、做過本次實(shí)驗(yàn)后，你認(rèn)為在制備培養(yǎng)基時(shí)要注意些什么問題？ 3、滅菌在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中有何重要意義？ 4、試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。 5、高壓蒸汽滅菌時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？ 實(shí)驗(yàn)四 純種微生物的分離、轉(zhuǎn)種和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：基礎(chǔ)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：3學(xué)時(shí)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、了解微生物分離和純化的原理；2、掌握常用的分離純化微生物的方法；3、掌握菌落特征的觀察；4、學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)； 

38、; 5、 建立無菌操作的概念，掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)。二、實(shí)驗(yàn)原理 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個(gè)菌落并不

39、一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。 土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類型的微生物。 將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。無論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定以及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進(jìn)行接

40、種。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無菌操作，如操作不慎引起污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可靠，影響下一步工作的進(jìn)行。三、實(shí)驗(yàn)材料 1 培養(yǎng)基和菌種淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號(hào)培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基，活性污泥混合液。普通瓊脂斜面和平板,營養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。2 溶液或試劑10%酚液，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。 3 儀器或其它用具 無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、涂布器等。酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環(huán)、

41、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。 四、實(shí)驗(yàn)步驟1、流程 倒平板制備梯度稀釋液涂布（或劃線法）培養(yǎng)挑單菌落保存。 2、步驟 2.1稀釋涂布平板法   倒平板 將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化待冷至5560時(shí)，高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入鏈霉素溶液(終濃度30g/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。 倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹觯嚬芑蚱靠诒３謱?duì)著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋

42、后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。   制備活性污泥混合液稀釋液 稱取土樣l0g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管。   涂

43、布 將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6，從三管活性污泥混合液稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。用無菌玻璃涂棒，右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。   培養(yǎng) 將高氏I號(hào)培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28溫室中培養(yǎng)35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37溫室中培養(yǎng)23d。   觀察并挑菌落將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落根據(jù)其大小、顏色、形狀

44、等特征進(jìn)行觀察，之后根據(jù)菌落不同特征分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上，分別置28和37溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。   平板劃線分離法   倒平板 按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。   劃線 在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-l的活性污泥混合液懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落。用接種環(huán)以無菌操作挑取活性污泥混合液懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平

45、行劃線34條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。   挑菌落  同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。 3、常用四種接種方法操作指導(dǎo)：斜面接種法：斜面接種法主要用于接種純菌，使其增殖后用以鑒定或保存菌種。通常先從平板培養(yǎng)基上挑取分離的單個(gè)菌落，或挑取斜面，肉湯中的純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基上。操作應(yīng)在無菌室、接種柜或超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，先點(diǎn)燃酒精燈。將菌種斜面培養(yǎng)基(簡稱菌

46、種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(簡稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對(duì)齊，應(yīng)斜持試管呈4550度角，并能清楚地看到兩個(gè)試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。以右手在火焰旁轉(zhuǎn)動(dòng)兩管棉塞，使其松動(dòng)，以便接種時(shí)易于取出。右手持接種環(huán)柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環(huán)和絲）必須燒紅，以達(dá)到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，要徹底灼燒以免滅菌不徹底。用右手的小指和手掌之間及無名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過，以殺滅可能沾污的微生物。棉塞應(yīng)始終夾在手中如掉落應(yīng)更換

47、無菌棉塞。將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上，待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出，接種環(huán)不能通過火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做S形劃線。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后，放回原處，并塞緊棉塞。將接種管貼好標(biāo)簽或用玻璃鉛筆劃好標(biāo)記后再放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。 液體接種法：多用于增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)，也可用純培養(yǎng)菌接種液體培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗(yàn)，其操作方法與注意事項(xiàng)與斜面接種法基本相同，僅將不同點(diǎn)介紹如下：由斜面培養(yǎng)物接種至液體培養(yǎng)基：用接種環(huán)從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)在管內(nèi)靠近液面試管壁上將菌苔輕輕研

48、磨并輕輕振蕩，或?qū)⒔臃N環(huán)在液體內(nèi)振搖幾次即可。如接種霉菌菌種時(shí)，若用接種環(huán)不易挑起培養(yǎng)物時(shí)，可用接種鉤或接種鏟進(jìn)行。由液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時(shí)，可用接種環(huán)或接種針沾取少許液體移至新液體培養(yǎng)基即可。也可根據(jù)需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可。接種液體培養(yǎng)物時(shí)應(yīng)特別注意勿使菌液濺在工作臺(tái)上或其他器皿上，以免造成污染。如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈。凡吸過菌液的吸管或滴管，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器內(nèi)。 固體接種法：普通斜面和平板接種均屬于固體接種，斜面接種法已講了，不再贅述。固體接種的另一種形式是接種固體曲料，進(jìn)行固體發(fā)酵。按所用菌種或種子菌來源不同可分為：

49、用菌液接種固體料，包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養(yǎng)的種子發(fā)酵液。接種時(shí)按無菌操作將菌液直接倒入固體料中，攪拌均勻。但要注意接種所用水容量要計(jì)算在固體料總加水量之內(nèi)，否則會(huì)使接種后含水量加大，影響培養(yǎng)效果。用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌。將種子菌于無菌條件下直接倒入無菌的固體料中即可，但必須充分?jǐn)嚢枋怪旌暇鶆颉Ｒ话闶窍劝逊N子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。穿刺接種法：此法多用于半固體、醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養(yǎng)基的接種，操作方法與注意事項(xiàng)與斜面接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環(huán)。接種柱狀高層或半高層斜面培養(yǎng)管時(shí)，應(yīng)向培

50、養(yǎng)基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動(dòng)，以使穿刺線整齊，便于觀察生長結(jié)果。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)該以所做涂布平板法和劃線法較好地得到了單菌落為目的，如果不是，請(qǐng)分析其原因并重做。六、思考題 1、如何確定平板上某單個(gè)菌落是否為純培養(yǎng)？在平板上你分離得到哪些類群的微生物？簡述它們的菌落特征。 2、為什么高氏I號(hào)培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對(duì)青霉素具有抗性的細(xì)菌，你認(rèn)為應(yīng)如何做？3、試述如何在接種中，貫徹?zé)o菌操作的原則? 4、以斜面上的菌種接種到新的斜面培養(yǎng)基為例說明操作方法和注意事項(xiàng)。 5、試設(shè)計(jì)一個(gè)

51、實(shí)驗(yàn)，從土壤中分離酵母菌。實(shí)驗(yàn)五 有機(jī)污染物質(zhì)的生物降解實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：綜合性實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握微生物在環(huán)境污染物降解中的原理和重要作用；2、掌握污染物測定的測定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理有機(jī)污染物廣泛存在自然環(huán)境中，絕大多數(shù)污染物可以在微生物的作用下被降解，本實(shí)驗(yàn)以表面表面活性劑為模式有機(jī)污泥物進(jìn)行生物降解實(shí)驗(yàn)。表面表面活性劑是合成洗滌劑的主要有效成分，目前應(yīng)用較多的是直鏈型烷基苯磺酸鹽類(LAS)。環(huán)境中表面活性劑的消失幾乎全靠微生物的作用，微生物通過其特殊的酶系的降解能力受到菌株類型、表面活性劑濃度及其他多種物理化學(xué)因素的影響。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用一

52、株由處理洗滌劑工業(yè)廢水的塔式生物濾池中分離得到的LAS降解菌，考查不同起始濃度LAS對(duì)微生物降解度的影響。三、器材與用品1.菌種：氣單胞菌D-4(Aeromonas spD-4，可由中國科學(xué)院水生生物研究所提供)；YM8菌株（由本實(shí)驗(yàn)中心在活性污染中分離）。合成洗滌劑*（含LAS者）：0.02-0.12%；蛋白胨：0.5%；NaCl：0.5%；NH4NO3：0.5%；KH2PO4：0.1%；K2HPO4：0.1%；蒸餾水：100ml。調(diào)節(jié)pH至6.7-7.2，121高壓蒸汽滅菌20分鐘。*分別配制四種含不同LAS濃度的培養(yǎng)液，使其LAS含量為40、120、180及240mg/L?？筛鶕?jù)所采用的

53、洗滌劑型號(hào)中LAS含量換算，再經(jīng)實(shí)測（LAS測定見本實(shí)驗(yàn)“測定方法”項(xiàng)）。培養(yǎng)液分裝于500ml三角瓶，每瓶注100ml，不同LAS濃度標(biāo)記清楚，121高壓蒸汽滅菌20分鐘備用。2SO4及50g NaH2PO4·2H2O, 用蒸餾水溶解后加入容量瓶并稀釋至1000ml刻度處。 4LAS標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取純LAS (99.5%LA S標(biāo)準(zhǔn)品可由上海有機(jī)化學(xué)研究所提供)，溶于蒸餾水，稀釋至500ml，此液LAS濃度為1mg/ml。取此液10ml稀釋至1000ml,則LAS濃度為0.01mg/ml。2SO4及50g NaH2PO4·2H2O ,溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。6恒溫振

54、蕩器。7分光光度計(jì)(具波長652nm)。8離心機(jī)。9500ml三角瓶、250ml分液漏斗、50、100、500及1000ml容量瓶、量筒、吸管、脫脂棉等。四、方法和步驟 1接種：取氣菌株斜面菌種1支，以10ml無菌水洗下菌苔，充分搖勻打散，制成濃菌液。每瓶培養(yǎng)液中接入菌液1ml；每種LAS濃度接2瓶，另設(shè)1瓶不接種作對(duì)照。2培養(yǎng)：將接種與不接種之對(duì)照瓶置震蕩器上，控制轉(zhuǎn)速為170-220r/min，于32±1恒溫震蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)實(shí)時(shí),將培養(yǎng)液離心以除去菌體(8000r/min離心10分鐘或4000r/min離心30分鐘)。離心后之上清液留作測定LAS用。3LAS測定：LAS和

55、美藍(lán)可生成藍(lán)色化合物，并溶于氯仿等有機(jī)溶劑中。(1)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取0、2、5、10、15、20 ml LAS標(biāo)準(zhǔn)液(0.01mg/m1)分別稀釋至100 ml制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液。將標(biāo)準(zhǔn)液100ml裝于250 m1分液漏斗中，用H2S04調(diào)節(jié)pH至微酸性，加美藍(lán)液25ml。 氯仿提?。合蛏鲜龇忠郝┒分屑勇确?0ml，猛烈振蕩30秒鐘，靜置分層，將氯仿層排入另一個(gè)250m1分液漏斗中。如此提取三次。 洗滌：在上述接納了三次氯仿提取液的分液漏斗中加入50ml洗滌液，猛烈振蕩30秒鐘，靜置分層。將一小塊脫脂棉塞入分液漏斗活塞下部以濾除水珠，分液漏斗中的氯仿層緩緩放下至一個(gè)50 ml容量瓶中。 再次提

56、?。杭勇确?ml于上述分液漏斗的水液中,振蕩分層后將氯仿層并入上述容量瓶中。如此提取三次。然后用氯仿將容量瓶中液體稀釋至50 ml刻度處。×所取該液的ml數(shù))作橫坐標(biāo)，制取標(biāo)準(zhǔn)曲線。并通過圖解法求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率K。(2)培養(yǎng)液測定：吸取離心后的培養(yǎng)液上清液1-10ml，放于250m1分液漏斗中，用蒸餾水稀釋至100ml。以下步驟同繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的步驟，測得樣品的氯仿提取液之光密度值。按下式計(jì)算樣品中LAS濃度。LAS(mg/L)OD652×1000/（標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率×水樣體積）×100%4LAS降解度計(jì)算D（C0Ct）/C0×100%D：降解度

57、%C0：振蕩培養(yǎng)開始時(shí)的起始LAS濃度(mg/L)Ct:：振蕩培養(yǎng)若干小時(shí)后的殘留LAS濃度(mg/L)如果未接菌液的空白對(duì)照液經(jīng)培養(yǎng)后，LAS也有所減少，且其差值為C(mg/L)，則DC0(Ct+C)/C0×100%五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及報(bào)告將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表。表 LAS起始濃度對(duì)微生物降解度的影響起始LAS濃度（mg/L）40120180240接種不接種接種不接種接種不接種接種不接種培養(yǎng)后殘留LAS濃度降解度（%）六、思考題1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了什么問題？2、參考本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一個(gè)污染物微生物降解實(shí)驗(yàn)（要求有污染物的測定方法）。實(shí)驗(yàn)六 雙歧桿菌酸口服液的發(fā)酵制備實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：綜合性實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)分離和純化菌株的方法； 2、學(xué)習(xí)營養(yǎng)口服液的制作方法及過程；3、初步了解食品藥品生產(chǎn)時(shí)的管理規(guī)定和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)