毛細(xì)管電泳高頻電導(dǎo)法測定夏枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量

1、毛細(xì)管電泳高頻電導(dǎo)法測定夏枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量         【摘要】  目的 建立夏枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量測定方法。方法 以布洛芬為內(nèi)標(biāo)，采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳，高頻電導(dǎo)檢測；未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱55 cm×75 m ID，有效長度46 cm；1.2 mmol/L三乙胺HCl（pH=10.60）， 環(huán)糊精（0.08 mmol/L）為運(yùn)行緩沖        【摘要】; 目的 建立夏枯草中齊墩果酸和熊

2、果酸的含量測定方法。方法 以布洛芬為內(nèi)標(biāo)，采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳，高頻電導(dǎo)檢測；未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱55 cm×75 m ID，有效長度46 cm；1.2 mmol/L三乙胺HCl（pH=10.60）， 環(huán)糊精（0.08 mmol/L）為運(yùn)行緩沖液；分離電壓12.5 kV；重力進(jìn)樣10 s（高度20 cm）。結(jié)果 齊墩果酸、熊果酸線性范圍分別為4.1114.8 g/mL（r=0.9995）和4.3120.4 g/mL（r=0.9996）；平均回收率分別為96.7%和98.2%。結(jié)論 該法簡便、準(zhǔn)確、快速、重現(xiàn)性好，可用于夏枯草藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量測定。 【關(guān)鍵詞】; 毛細(xì)管

3、電泳；高頻電導(dǎo)檢測；夏枯草；齊墩果酸；熊果酸Abstract:Objective To establish a method for determining the content of oleanolic acid and ursolic acid in Prunella vulgaris. Methods; Capillary electrophoresis with high frequency conductivity detector was used to analyze the sample. The separation was performed on a uncoated

4、fused silica capillary of 55 cm×75 m（46 cm effective length）using 1.2 mmol·L-1 triethylamine as washing buffer (containing 0.08 mmol·L-1 cyclodextrin, pH 10.60). The voltage was 12.5 kV and temperature was 25 . The sample was injected by gravity（10 s，20 cm）. Results; The linear ranges

5、 of oleanolic acid and ursolic acid were 4.1114.8; g/mL（r=0.9995）and 4.3120.4; g/mL（r=0.9996）, respectively. The average recoveries of oleanolic acid and ursolic acid were 96.7% and 98.2%, respectively. Conclusion; This method is reliable，rapid and accurate, which could be used for the quantitative

6、analysis of the contents of oleanolic acid and ursolic acid in Prunella vulgaris.Key words:capillary electrophoresis；high frequency conductivity detector；Prunella vulgaris；oleanolic acid；ursolic acid夏枯草為中醫(yī)臨床常用中藥，味辛、苦，性寒，具有消火、明目、散結(jié)、消腫的作用，用于目赤腫痛、目珠底痛、頭痛眩暈、高血壓等1。夏枯草中含有多種三萜類成分，以齊墩果酸（oleanolic acid， OA）和

7、熊果酸（ursolic acid，UA）的含量較高，OA和UA屬于構(gòu)造異構(gòu)體，在分離時(shí)具有一定難度。目前有關(guān)的含量測定方法有薄層色譜法2、高效液相色譜法3,4、氣相色譜法5、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法6等檢測方法。本文采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis,CZE），高頻電導(dǎo)（high frequency conductivity detection）檢測的方法7，對不同產(chǎn)地夏枯草藥材中OA和UA的含量進(jìn)行測定，為藥材質(zhì)量控制提供了可借鑒的依據(jù)。1; 儀器與試藥; CES2003毛細(xì)管電泳儀，包括高壓電源、高頻電導(dǎo)檢測器及毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)工作站（中山大學(xué)化學(xué)與

8、化學(xué)工程學(xué)院研制）。ORION MODEL 828型pH計(jì)（美國）。DL360超聲波清洗器（寧波石浦海天電子儀器廠），工作頻率（4.5±5%） kHz，輸出功率240 W。未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱（75 m ID，河北永年銳灃色譜器件有限公司）。; 夏枯草樣品（批號1：購自河南；批號2：購自安徽；批號3：購自貴州），均經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥鑒定教研室房志堅(jiān)副教授鑒定為真品。將其粉碎，于60 下干燥4 h，置干燥器內(nèi)備用。定量方法學(xué)考察采用的樣品購自河南。; 齊墩果酸對照品（批號：110709200505）、熊果酸對照品（批號：110742200516）、布洛芬對照品（批號：1001792

9、00303）均由中國藥品生物制品檢定所提供，環(huán)糊精（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司），三乙胺等試劑均為分析純，水為去離子水（電阻為16.6 M·cm-1）。2; 實(shí)驗(yàn)部分2.1; 溶液的制備2.1.1; 內(nèi)標(biāo)溶液; 精密稱取布洛芬對照品40.6 mg置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)貯備液（質(zhì)量濃度為812 g/mL）。2.1.2; 對照品溶液; 精密稱取OA對照品16.4 mg、UA對照品17.2 mg置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（質(zhì)量濃度分別為328 g/mL和344 g/mL）。2.1.3; 供試品溶液; 取本品粉末約

10、1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇80 mL，加熱回流2 h，放冷，提取液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 m濾膜過濾，作為供試品溶液。2.2; 電泳條件; 未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱55 cm×75 m ID，有效長度46 cm；以1.2 mmol/L三乙胺HCl（pH=10.60），環(huán)糊精（0.08 mmol/L ）為運(yùn)行緩沖液；分離電壓12.5 kV；重力進(jìn)樣10 s（高度20 cm）；溫度25 ，濕度小于45%。毛細(xì)管柱在使用前依次用去離子水、0.1 mol·L-1的NaOH溶液、去離子水、緩沖液各沖洗5 min；檢測電極和緩沖液容器用

11、超聲波清洗10 min。進(jìn)樣5次之后需按照上述步驟清洗毛細(xì)管。對照品、樣品色譜圖見圖1。2.3; 方法學(xué)考察2.3.1; 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備; 分別吸取一定量的對照品貯備液、內(nèi)標(biāo)溶液，加甲醇稀釋成含齊墩果酸質(zhì)量濃度為4.1、8.2、16.4、32.8、49.2、82.0、114.8 g/mL，熊果酸質(zhì)量濃度為4.3、8.6、17.2、34.4、51.6、86.0、120.4 g/mL與內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度均為40.6 g/mL的系列溶液。依次重力進(jìn)樣10 s，每個(gè)濃度測定3次以上。以對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），對照品溶液的質(zhì)量濃度（）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得回歸方程YOA =0.012-

12、0.032 1（r=0.999 5）；YUA=0.011 9-0.030 9（r=0.999 6）。表明OA質(zhì)量濃度在4.1114.8 g/mL、UA質(zhì)量濃度在4.3120.4 g/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。1.齊墩果酸； 2.熊果酸； 3.布洛芬； 4.水圖1; 對照品（A）和樣品（B）的毛細(xì)管電泳色譜圖（略）Fig.1; HPCE chromatograms of the controls (A) and samples (B）2.3.2; 精密度試驗(yàn); 取質(zhì)量濃度分別為82.0、86.0 g/mL的OA與UA對照品溶液，重力進(jìn)樣10 s，連續(xù)測定5次，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果OA的RSD=2.48%、UA的RSD=3.73%，表明儀器精密度良好。2.3.3; 穩(wěn)定性試驗(yàn); 取供試品溶液（批號1）在0、2、4、8、24 h，分別重力進(jìn)樣10 s，記錄峰面積。結(jié)果OA的RSD=4.54%、UA的RSD=1.21%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.3.4; 重復(fù)性試驗(yàn); 取同一批號（批號1）樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法提取、測定。結(jié)果OA的平均含量為1.01 mg·g-1，RSD=4.10%（n=6