反相高效液相色譜法測定半枝蓮中原兒茶酸的含量

1、反相高效液相色譜法測定半枝蓮中原兒茶酸的含量【摘要】 目的建立半枝蓮藥材中原兒茶酸的含量測定方法。方法樣品用30的乙醇回流提取，提取液濾過，以反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定。用DiamonsilTM C18色譜柱（250 mm4.6 mm，5 m），以甲醇-0.05磷酸為流動相，流速為1.0 ml?min-1，檢測波長為258 nm。結(jié)果原兒茶酸的保留時(shí)間約為7 min，且與其它峰的分離度大于1.5。原兒茶酸的線性范圍為0.0180.184 g（r=0.999 8），最低檢測限為3 ng，平均回收率和RSD分別為99.7%和0.27%。結(jié)論該方法簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為半枝蓮藥材

2、的質(zhì)量評價(jià)提供有效手段。 【關(guān)鍵詞】 反相高效液相色譜法 半枝蓮 原兒茶酸 含量測定RP-HPLC Determination of Protocatechuic Acid in Scutellaria barbaraAbstract:ObjectiveTo establish a method to determine the content of protocatechuic acid in Scutellaria barbara. MethodsThe sample was extracted with 30% EtOH under reflux, and then the extrac

3、t solution was filtered. RP-HPLC was used for the determination of protocatechuic acid in Scutellaria barbata. The chromatographic procedure was carried out using DiamonsilTM C18 as an analytic column and a mixture of 25 volume of methanol, 75 volume of 0.05% phosphoric acid as a mobile phase at a f

4、low rate of 1.0 ml?min-1. The detection wavelength was set at 258 nm. ResultsThe peak of protocatechuic acid appeared for about 7 minutes. Resolution of protocatechuic acid was more than 1.5 and its linear range was between 0.018 and 0.184 g (r=0.999 8).The minimum limit of detection was 3 ng. The a

5、verage recovery and RSD value of protocatechuic acid were 99.7% and 0.27%, respectively. ConclusionThis method is sensitive and quick and can be used for the quality control of Scutellaria barbara.Key words:RP-HPLC； Scutellaria barbara； Protocatechuic acid； Assay 半枝蓮為唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Do

6、n的干燥全草，其味辛、苦，性寒，清熱解毒，化淤利尿。主要用于治療疔瘡腫毒、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌撲傷痛、水腫、黃疸等癥1。半枝蓮中主要含有各種黃酮類成分如野黃芩苷、木犀草素、黃芩素、漢黃芩素等（另文發(fā)表）；芳香酸類成分如原兒茶酸及多種萜類、脂肪族化合物和多糖類成分2。原兒茶酸對金色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌等都有明顯的抑制作用，并有收斂和促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，但迄今為止未見有高效液相色譜法測定半枝蓮藥材中原兒茶酸含量的文獻(xiàn)報(bào)道。本文首次采用了RPHPLC法對其進(jìn)行了含量測定。本方法簡便、快捷，準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，可用于半枝蓮中原兒茶酸的含量測定，為藥材的質(zhì)量控制建

7、立了分析方法。1 儀器與試藥 Waters高效液相色譜儀（美國）：1525泵，2487紫外檢測器；Empower工作站；TCQ-250超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）。 試劑：甲醇（色譜純，美國迪馬公司），水為二次蒸餾水，其它試劑均為分析純。 原兒茶酸對照品（批號：110809200503，供含量測定用），半枝蓮對照藥材（批號：121293200402）均由中國藥品生物制品檢定所提供。本文收集了24個(gè)不同產(chǎn)地的半枝蓮藥材樣品（經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室聶鳳?|教授鑒定）及半枝蓮對照藥材。2 方法與結(jié)果32.1 色譜條件色譜柱：迪馬公司DiamonsilTM C18分析柱（250 mm4.

8、6 mm，5 m）；流動相：甲醇-0.05%磷酸；流速：1.0 ml?min-1；檢測波長：258 nm；進(jìn)樣量均為20 l；靈敏度：2.0 AUFS。在以上色譜條件下，樣品中原兒茶酸與其它組分的色譜峰分離度良好。見圖1。2.2 供試品溶液的制備取本品粉末（過60目篩）約2 g，精密稱定，置50 ml圓底燒瓶中，精密加入30%乙醇25 ml，稱定重量，回流1 h。放冷，稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)充減失的量，搖勻，用0.45 m的微孔濾膜濾過，即得。 2.3 對照品貯備液的制備精密稱取原兒茶酸對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.092 mg的溶液，即得。2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍分別精密量取原

9、兒茶酸對照品貯備液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.0 ml，置10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得不同濃度的對照品溶液。分別吸取20 l注入液相色譜儀，測定峰面積。以進(jìn)樣量X（g）為橫坐標(biāo)，峰面積（107）Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)回歸處理得回歸方程為：Y4.094 6X0.001 4，r0.999 8（n6）。原兒茶酸在0.0180.184 g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分別于0，2，4，6，8 ，24 h精密吸取供試品溶液，進(jìn)樣測定，按上述色譜條件測定峰面積。供試品溶液于24 h內(nèi)，色譜峰面積無明顯變化，RSD為0.63%。結(jié)果表明在24 h內(nèi)供

10、試品溶液穩(wěn)定。2.6 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取上述供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定峰面積。原兒茶酸峰面積的RSD為0.41%，表明該法的精密度良好。2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批半枝蓮藥材粉末（過60目篩）約2 g，共6份，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算含量，其RSD為0.86%，表明該法重現(xiàn)性良好。2.8 最低檢測限實(shí)驗(yàn)取上述對照品貯備液，逐步稀釋，進(jìn)樣，直至信噪比S/N3，此時(shí)進(jìn)樣量即為最低檢測限。原兒茶酸的最低檢測限為3 ng。2.9 回收率實(shí)驗(yàn)取已知原兒茶酸含量為59.61 g?g-1的半枝蓮藥材粉末（過60目篩）約1 g，共6份，精密稱定。分

11、別精密量取上述原兒茶酸對照品儲備液0.7 ml，加入上述6份藥材中，按“2.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液。測定其平均回收率為99.7%，RSD為0.27%。可見本方法的準(zhǔn)確度高，精密度好，方法可行。2.10 樣品測定取24批半枝蓮藥材粉末（過60目篩）約2 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，然后計(jì)算其含量。結(jié)果見表1。3 討論3.1 本文采用HPLC法測定了24批不同產(chǎn)地半枝蓮藥材中原兒茶酸的含量，該方法簡便、快速，準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，可作為半枝蓮中原兒茶酸的含量測定方法，為半枝蓮藥材的質(zhì)量控制提供有效手段。3.2 由表1可見，原兒茶酸為不同產(chǎn)地半枝蓮的

12、共有成分，產(chǎn)地不同的半枝蓮中原兒茶酸含量有較大差別。安徽產(chǎn)半枝蓮含量最高，為76.85g?g-1；湖北產(chǎn)半枝蓮含量最低，為12.08 g?g-1。表1 不同產(chǎn)地半枝蓮藥材中原兒茶酸的含量（略）3.3 在流動相中分別加入0.1%磷酸、0.05%磷酸和0.1%冰醋酸，比較分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.05%磷酸的分離效果最佳，同時(shí)克服了加入冰醋酸基線易漂移的缺點(diǎn)。3.4 經(jīng)HPLC-DVD測定表明在258 nm處原兒茶酸有最大吸收且干擾較少，分離效果良好，與文獻(xiàn)報(bào)道一致4，故選用此波長。 3.5 本文曾試過超聲振蕩提取和熱乙醇回流法，結(jié)果證明熱乙醇回流法提取效率高。本文還就不同提取時(shí)間（0.5，1，2，3 h），不同醇濃度（30%乙醇，60%乙醇，90%乙醇，25%甲醇，50%甲醇，75%甲醇）分別進(jìn)行了比較試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明30%乙醇的提取率最高，因此選擇了30%乙醇回流1 h作為供試品溶液的制備