重慶大學(xué)考研分子生物學(xué)題庫(kù)+答案

1、2010年 高等分子生物學(xué)高級(jí)分子生物學(xué)1.試述利用基因工程的技術(shù)調(diào)控基因表達(dá)的主要方法原位雜交技術(shù)原位雜交(In Situ Hybridization,ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。通常可以分為兩大類：1、RNA原位雜交：用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，就可以通過(guò)檢測(cè)放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞水平上作出定性定量分析；2、熒光原位雜交(Fluorescence I

2、n Situ Hybridization,FISH)：首先對(duì)于寡核苷酸探針做特殊修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過(guò)與熒光素分子相偶聯(lián)的單克隆抗體來(lái)確定該DNA序列在染色體的位置。定點(diǎn)突變技術(shù)定點(diǎn)突變是重組DNA進(jìn)化的基礎(chǔ)，該方法通過(guò)改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來(lái)改變所編碼的氨基酸序列，常用于研究某個(gè)氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。RNAi技術(shù)RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷體內(nèi)靶

3、基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。其過(guò)程一般為：1、在Dicer的參與下，細(xì)胞中的雙鏈RNA首先被降解形成21-25個(gè)核苷酸的小片段雙鏈RNA(siRNA)；2、siRNA中的反義鏈指導(dǎo)合成一種被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)的核蛋白體；3、RISC再介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾基因表達(dá)的功能。2.論述原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控的異同答：1、真核生物基因組大,染色體數(shù)量多,且結(jié)構(gòu)復(fù)雜,存在基因家族和斷裂基因；原核生物基因組小,染色體數(shù)量少,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,有重疊基因和操縱子結(jié)構(gòu)，基因表達(dá)調(diào)控可以在復(fù)制、擴(kuò)增、基因激活、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后

4、等多級(jí)水平上進(jìn)行,但轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是主要的。真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制發(fā)生在染色體活化、基因轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯及翻譯后加工等多水平的調(diào)節(jié)，事件也復(fù)雜的多。2、真核生物基因表達(dá)以正調(diào)控為主，基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān),真核基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核(線粒體基因的轉(zhuǎn)錄在線粒體內(nèi)),需對(duì)內(nèi)含子精確剪接加工，翻譯則多在胞漿,兩個(gè)過(guò)程是分開的?；虮磉_(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)比原核生物更多。原核生物中,營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境因素對(duì)基因表達(dá)調(diào)控起舉足輕重的作用，mRNA在形成過(guò)程中與核糖體混合在一起，即轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程相耦聯(lián)。3.簡(jiǎn)述互補(bǔ)篩選（藍(lán)白斑篩選）適用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的載體，如 pUC系列等

5、，其原理是：載體含有LacZ的調(diào)控序列和N端146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。當(dāng)這種載體進(jìn)入可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞后（質(zhì)粒和宿主細(xì)胞編碼的片段各自都沒(méi)有酶活性），它們可以融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)，這種現(xiàn)象叫互補(bǔ)。由互補(bǔ)而產(chǎn)生的 Lac+ 細(xì)菌在呈色底物 X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG存在下形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)互補(bǔ)能力的氨基端片段。因此，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。通過(guò)呈色反應(yīng)即可初步識(shí)別可能帶有重組質(zhì)粒的菌落。通過(guò)小量制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析，即可確定這些質(zhì)粒的

6、結(jié)構(gòu)。4.簡(jiǎn)述菌落PCR篩選該方法是以轉(zhuǎn)化菌單個(gè)克隆為模板，采用特異性引物或通用引物對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過(guò)凝膠電泳等手段來(lái)鑒定篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，最后可以經(jīng)提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切和質(zhì)粒PCR雙重鑒定以及測(cè)序分析進(jìn)一步確認(rèn)菌落PCR的結(jié)果。5.簡(jiǎn)述雜交探針技術(shù)的原理和方法在制備好合適的基因文庫(kù)后，如果用可獲得目的基因的互補(bǔ)DNA或RNA做探針，就可以利用核酸雜交技術(shù)鑒定出特定的重組體克隆。原理：任兩條單鏈核酸分子都有相互形成堿基對(duì)的趨勢(shì)，但形成的大多數(shù)分子對(duì)由于只有少數(shù)鏈間氫鍵形成，雜交結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，如果多聚核苷酸鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，堿基對(duì)的大量形成使雙鏈分子穩(wěn)定。步驟：1、把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到

7、硝酸纖維膜上，處理除去雜質(zhì)，只留下DNA，使DNA分子變性，雙螺旋之間的氫鍵斷裂2、短時(shí)間的加熱會(huì)使這些單鏈DNA分子牢固結(jié)合到膜上。DNA分子與膜結(jié)合其堿基是自由的，可以自由配對(duì)。3、然后把探針加上標(biāo)簽，加熱變性，再加到適宜核酸退火的化學(xué)溶液中與膜結(jié)合。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，等雜交發(fā)生后，洗去沒(méi)有結(jié)合的探針，干燥，檢測(cè)結(jié)合的探針的位置，從而篩選出想要獲得陽(yáng)性克隆。6.對(duì)天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建、改造通常需要對(duì)質(zhì)粒哪些方面進(jìn)行操作、改進(jìn)?答：對(duì)于天然質(zhì)粒應(yīng)該做以下幾方面的操作、改進(jìn)：1.刪除一些非必要的區(qū)段及對(duì)宿主有不良影響的區(qū)段2.削減載體的分子量，是載體具有更大的容納外源片段的能力3.加上易于選擇或檢測(cè)

8、的標(biāo)記，以便篩選出陽(yáng)性克隆4.限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的改造，便于外源基因插入到載體的特定位置5.加上一些調(diào)控元件，有利于基因的表達(dá)6.安全性改造（因?yàn)槭呛?jiǎn)答題，以下四點(diǎn)可以不要，但建議最好要）:（1）非傳遞性和不被帶動(dòng)轉(zhuǎn)移。在基因工程操作中，不希望載體能夠進(jìn)行自主傳遞，也不希望被帶動(dòng)轉(zhuǎn)移；（2）具有條件致死突變。如溫度敏感時(shí)就喪失復(fù)制能力，可防止克隆基因擴(kuò)散，只存在于限定的宿主細(xì)胞中；（3）一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因?yàn)橹亟M后可能給宿主帶來(lái)突變；（4）有較小的宿主范圍。7. 大腸桿菌乳糖操縱子的主要結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)機(jī)制。答：大腸桿菌的乳糖操縱子（LAC操縱子）含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分

9、別編碼半乳糖苷酶、透酶、乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱基因O、一個(gè)啟動(dòng)子P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼一種與O基因結(jié)合的阻遏蛋白，使操縱子受阻遏而處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)。在P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結(jié)合位點(diǎn)。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成LAC操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。調(diào)節(jié)機(jī)制：分阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機(jī)制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。1、阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)：在沒(méi)有乳糖存在時(shí)，I基因表達(dá)的乳糖阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)；當(dāng)有乳糖存在時(shí)，經(jīng)透酶催化、轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，再經(jīng)原先存在于細(xì)胞中的少數(shù)-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

10、別乳糖，與阻遏蛋白結(jié)合，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，使-半乳糖苷酶分子急劇增加。2、CAP的正調(diào)節(jié)：當(dāng)沒(méi)有葡萄糖及cAMP濃度較高時(shí)，cAMP與CAP結(jié)合，這時(shí)CAP結(jié)合在乳糖啟動(dòng)序列附近的CAP位點(diǎn)，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性；當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結(jié)合受阻，因此乳糖操縱子表達(dá)下降。8. 試說(shuō)明真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄，翻譯及DNA的空間結(jié)構(gòu)方面存在的主要差異，表現(xiàn)在哪些方面？比較原核、真核基因組異同（1）染色體方面：原核生物為環(huán)狀DNA分子，且DNA裸露或結(jié)合少量蛋白質(zhì)，只有一個(gè)基因連鎖群；真核生物為線性雙鏈DNA分子，且DNA同組蛋白和非組蛋白結(jié)合，有2

11、個(gè)以上基因連鎖群。（2）染色體遺傳物質(zhì)：原核生物為質(zhì)粒，真核生物為細(xì)胞器基因組。（3）轉(zhuǎn)錄單元：原核生物為多順?lè)醋?，真核生物為單順?lè)醋?，基因家族。?）DNA序列：原核生物無(wú)或很少有重復(fù)序列，真核生物有重復(fù)序列。（5）基因表達(dá)：原核生物RNA和蛋白質(zhì)在同一區(qū)間合成，有重疊基因；真核生物RNA在核中合成和加工，蛋白質(zhì)在細(xì)胞中合成，有斷裂基因。比較原核、真核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程異同答：原核生物： 起始過(guò)程需RNA聚合酶核心酶，由亞基辨認(rèn)起始點(diǎn)（-35bp區(qū)）。在這一區(qū)段酶與模板的結(jié)合松弛，酶移向-10區(qū)并跨入轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。延長(zhǎng)過(guò)程的核苷酸聚合僅需核心酶催化。終止分依賴因子的和不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止。 真核生

12、物：轉(zhuǎn)錄起始前的-25bp區(qū)段有啟動(dòng)子的核心序列TATAbox。此外DNA分子上還具有其他可影響轉(zhuǎn)錄的順式作用元件，以及能辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段的反式作用因子。真核生物RNA聚合酶不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。真核生物的轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物大致相似。真核生物mRNA有polyA尾結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進(jìn)去的。轉(zhuǎn)錄不是在polyA位置上終止，而是超過(guò)數(shù)百甚至上千核苷酸后才停頓。比較原核、真核生物的翻譯異同1、原核生物與真核生物核蛋白體的組成不同。2、真核生物肽鏈合成起始過(guò)程與原核生物相似但更復(fù)雜。真核生物有不同的翻譯起始成分，起始因子種類更多，起始甲硫氨酸不需甲基化等。成熟的真核

13、mRNA有5'帽子和3'polyA尾結(jié)構(gòu)。3、真核生物肽鏈合成的延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物基本相似，只是有不同的反應(yīng)體系和延長(zhǎng)因子。4、真核生物的翻譯終止過(guò)程與原核生物相似。9.試說(shuō)明色氨酸操縱子（Trp operon)在原核基因表達(dá)調(diào)控中的調(diào)控機(jī)制和重要作用。 色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)系：（1）含有5種結(jié)構(gòu)基因：TrpE, D, C, B, A；（2）它的調(diào)控結(jié)構(gòu)：?jiǎn)?dòng)子，操縱子，前導(dǎo)序列，弱化子。（3）阻遏物Trp基因：它與Trp操縱子相距較遠(yuǎn)。大量Trp存在時(shí)，大腸桿菌的5種酶的轉(zhuǎn)錄同時(shí)受到抑制，Trp不足時(shí)，這5酶基因開始轉(zhuǎn)錄。前導(dǎo)序列中含有衰減子區(qū)域，在前導(dǎo)序列中第10位和第11位有

14、相鄰兩個(gè)色氨酸密碼子，參與轉(zhuǎn)錄弱化機(jī)制，弱化子對(duì)RNA聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置：（1）當(dāng)Trp濃度高時(shí)，可完整翻譯成短肽，核糖體可順利通過(guò)兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄前，核糖體就到達(dá)2區(qū)，這樣使2-3區(qū)不能配對(duì)，3-4區(qū)可自由配對(duì)形成莖-環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止。Trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因被關(guān)閉而不再合成色氨酸。（2） 當(dāng)Trp濃度低時(shí)，負(fù)載有Trp的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA也少，這樣翻譯通過(guò)兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度就會(huì)很慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)，核糖體才到達(dá)1區(qū)，這時(shí)的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是2-3區(qū)配對(duì)，不形成3-4區(qū)配對(duì)的終止結(jié)構(gòu)，故轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行，直到將Trp操縱子的結(jié)構(gòu)基

15、因全部轉(zhuǎn)錄。11. 闡述酵母轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的調(diào)控方式及其在酵母雙雜合系統(tǒng)(yeast two hybrid system)中的應(yīng)用。答：GAL4由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，一個(gè)是DNA結(jié)合域BD，一個(gè)是轉(zhuǎn)錄激活域AD，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但具有完整激活功能的GAL4必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)AD與BD結(jié)合后，形成的完整轉(zhuǎn)錄因子可以激活被BD結(jié)合的基因的表達(dá)。    將編碼待測(cè)蛋白X的DNA序列同編碼GAL4 BD的DNA序列整合在一個(gè)載體上，表達(dá)產(chǎn)生X-GAL4雜合蛋白；將編碼蛋白質(zhì)Y的DNA序列同編碼GAL4 AD的DNA序列整合在一個(gè)載體上，表達(dá)產(chǎn)生Y-GAL

16、4雜合蛋白。這兩種雜合蛋白都有核定位序列，當(dāng)這兩種載體同時(shí)轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞后，表達(dá)產(chǎn)生的兩種蛋白都定位在核內(nèi)。如果X和Y有相互作用，則分別融合在二者上的AD和BD就會(huì)組合成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄因子，激活與BD結(jié)合的報(bào)告基因的表達(dá)，從而知道待測(cè)蛋白間是否有相互作用。12. 分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件？常用的工具酶1、限制性核酸內(nèi)切酶：是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶。2、DNA連接酶：將兩段DNA分子拼接起來(lái)的酶。3、DNA聚合酶：催化單核苷酸鏈延伸。4、逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶，這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶，產(chǎn)物DNA又稱互補(bǔ)D

17、NA。5、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶：將脫氧核糖核酸加到DNA的3末端。6、堿性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基團(tuán)。7、依賴DNA的RNA聚合酶：識(shí)別特異性啟動(dòng)子，RNA轉(zhuǎn)錄。良好載體的條件1、必須有自身的復(fù)制子；2、載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入；3、載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽(yáng)性重組子和陰性重組子；4、載體分子必須有足夠的容量；5、可通過(guò)特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞；6、對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順序、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等DNA調(diào)控元件。13. SANGER雙脫氧鏈終止法的原理？答：DNA鏈中核苷酸以3,5-磷酸二酯

18、鍵連接，合成DNA所用的底物是2-脫氧核苷三磷酸。2,3ddNTP與普通dNTP不同，它們?cè)诿撗鹾颂堑?位置缺少一個(gè)羥基。在DNA聚合酶作用下通過(guò)三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA鏈中，但由于沒(méi)有3羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸。在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止位置間的距離。在4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。14. 核酸分子雜交的原理

19、、條件、影響因素？原理：互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行，它不僅能在DNA和DNA之間進(jìn)行，也能在DNA和RNA之間進(jìn)行。因此，當(dāng)用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時(shí)，如果兩者的堿基完全配對(duì)，它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測(cè)基因組DNA中含有已知的基因序列。必要條件：一是必需的特異的DNA探針；二是必需的基因組DNA。影響因素：1、核酸濃度越大，復(fù)性速度越快。探針長(zhǎng)度要適當(dāng)。2、溫度：溫度過(guò)高不利于復(fù)性，溫度過(guò)低，少數(shù)堿基配對(duì)形成的局部雙鏈不易解離。 3、低離子強(qiáng)度下，核酸雜交緩慢，隨著

20、離子強(qiáng)度的增加，反應(yīng)速率增加。 4、雜交液中甲酰胺能降低核酸雜交的TM值。5、核酸分子的復(fù)雜性，即存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長(zhǎng)度。6、在雜交前應(yīng)對(duì)非特異反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉，以減少其對(duì)探針的非特異性吸附作用。15. PCR的基本原理和過(guò)程？答：基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過(guò)程即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)步驟構(gòu)成的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目

21、的DNA得以迅速擴(kuò)增。1、變性：94，模板雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA。2、退火：引物單鏈DNA雜交鏈。3、延伸：溫度至70 左右， Taq DNA聚合酶以4種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物3末端為起點(diǎn)的53DNA鏈延伸反應(yīng)，形成新生DNA鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過(guò)變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，如此反復(fù)，使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增。16. PCR的反應(yīng)條件？1、PCR反應(yīng)的緩沖液：Tris-HCl緩沖液。KCl 促進(jìn)引物的退火，濃度太高時(shí)會(huì)抑制Taq DNA聚合酶活性。必要時(shí)加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高PCR反應(yīng)特異性。2、鎂離子

22、濃度：Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+濃度過(guò)低，會(huì)顯著降低酶活性。Mg2+濃度過(guò)高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。Mg2+濃度還會(huì)影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。   3、底物濃度： dNTPs濃度過(guò)高可加快反應(yīng)速度，也增加堿基的錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本。降低濃度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，可提高反應(yīng)的特異性。4種dNTP必須以等摩爾濃度配制，以減少PCR反應(yīng)的錯(cuò)配誤差并提高使用效率。4、Taq DNA聚合酶：75-80時(shí)具有最高的聚合酶活性，150個(gè)核苷酸/秒；具有良好的熱穩(wěn)定性，95仍有活性。5、引物：引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配或非特異性擴(kuò)增、生成引物二

23、聚體，使目的DNA片段產(chǎn)率下降。退火溫度與引物Tm值有關(guān)，引物Tm值在55-80 范圍較為理想。6、反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。17. 影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達(dá)的因素？答：1、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱；2、基因的劑量；3、影響RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的因素：SD序列、mRNA；4、外源基因密碼子的選擇；5、表達(dá)產(chǎn)物的大?。?、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。18. 大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因必須具備的條件？答：1、要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內(nèi)含子；2、表達(dá)的外源片段要位于大腸桿菌啟動(dòng)

24、子的下游，并形成正確的閱讀框架；3、轉(zhuǎn)錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻譯成蛋白質(zhì)。4、蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶快速降解，且對(duì)宿主無(wú)害。19. 真核細(xì)胞表達(dá)外源基因的條件？答：1、首先必須具備哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的功能元件。要求哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體帶有能在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；2、注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞，不同類型的細(xì)胞具有不同的特性；3、注意選擇適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記。20. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念、原理及應(yīng)用？答：概念、原理：借助基因工程技術(shù)把外源目的基因?qū)肷臣?xì)胞、胚胎干細(xì)胞和早期胚胎，并在受體染色體上穩(wěn)定整合，使之經(jīng)過(guò)各

25、種發(fā)育途徑得到能把外源目的基因傳給子代的個(gè)體。應(yīng)用 ：（1）在基因表達(dá)調(diào)控研究方面的應(yīng)用：利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為在體內(nèi)研究外源基因表達(dá)調(diào)控的“反應(yīng)器”；（2）用于基因產(chǎn)品的制備：把轉(zhuǎn)基因動(dòng)物看作是一種個(gè)體表達(dá)系統(tǒng)，使導(dǎo)入的目的基因表達(dá)，人們就可以從該動(dòng)物的乳汁和血液里獲得目的基因產(chǎn)物。21. 基因敲除的基本程序？答：通過(guò)DNA同源重組，使特定的內(nèi)源基因被破壞而造成功能喪失，然后通過(guò)介導(dǎo)得到該基因喪失的生物模型的過(guò)程。 以小鼠的某基因敲除為例：1、靶載體的同源序列要足夠長(zhǎng)，要含有篩選用的標(biāo)志基因；2、胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)；3、靶載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞；4、同源重組胚胎干細(xì)胞的篩選；5、基因敲除胚胎干細(xì)

26、胞注射入胚泡；6、胚泡植入假孕小鼠的子宮中；7、雜交育種獲得純合的基因敲除動(dòng)物。22對(duì)天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？答：天然質(zhì)粒往往存在著缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建：1、加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇，通常是抗生素基因。 2、增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組。3、縮短長(zhǎng)度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量。4、改變復(fù)制子情況，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝。5、根據(jù)特殊需求加裝特殊的基因元件。23. 利用雙脫氧末端終止法（Sanger法）測(cè)定DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的原理與方法？答：采用2，3-雙脫氧核苷酸，由于它缺少形成3，5磷酸二脂

27、鍵所需要的3-OH,一旦參入到DNA鏈中，此DNA鏈就不能進(jìn)一步延長(zhǎng)。根據(jù)堿基配對(duì)原則，每當(dāng)DNA聚合酶需要dNMP參入到正常延長(zhǎng)的DNA鏈中時(shí)，就有兩種可能性，一是參入ddNTP,結(jié)果導(dǎo)致脫氧核苷酸鏈延長(zhǎng)的終止，二是參入dNTP,使DNA鏈仍可繼續(xù)延長(zhǎng)直至參入下一個(gè)ddNTP。根據(jù)這一方法，就可得到一組以ddNTP結(jié)尾的長(zhǎng)短不一的DNA片段。反應(yīng)終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳，以分離長(zhǎng)短不一的核酸片段(長(zhǎng)度相鄰者僅差一個(gè)堿基)。再根據(jù)片段3端的雙脫氧堿基的情況，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。24. 典型的DNA重組實(shí)驗(yàn)通常包括哪些步驟？答：外源基因的獲得。如酶切法、反轉(zhuǎn)錄法人工合成法；載體的獲得。如質(zhì)粒、噬菌體；獲得重組體；重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞核。轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜交、細(xì)胞融合、顯微注射技術(shù)；對(duì)吸收重組DNA的細(xì)胞進(jìn)行篩選鑒定；對(duì)含有重組DNA細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)，檢測(cè)外源基因是否表達(dá)。25.提出一個(gè)將真核細(xì)胞中的mRNA與其他類型的RNA分開的方法。答：真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有3端的Poly(A)尾巴。A與dT可