“電針調(diào)節(jié)Noggin表達對VD大鼠學習記憶過程中海馬神經(jīng)發(fā)生的

1、“電針調(diào)節(jié)Noggin表達對VD大鼠學習記憶過程中海馬神經(jīng)發(fā)生的影響”申請書正文1、項目研究意義隨著人類社會進入21世紀，人口老齡化更加明顯，老年期癡呆成為一個嚴重的醫(yī)學和社會問題，而受到世界各國的關(guān)注。在我國，血管性癡呆是老年期癡呆的主要類型之一，且其發(fā)病率有逐年上升的趨勢。血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由腦血管因素導致腦組織損害引起的智能及認知功能障礙的臨床綜合征。研究顯示1，約25的腦卒中患者伴有程度不等的智能障礙，嚴重者不僅影響患者的生存質(zhì)量，而且增加了社會和家庭的經(jīng)濟負擔。海馬是目前公認與學習、記憶等高級神經(jīng)功能活動具有密切關(guān)系的重要腦區(qū)，而海馬最受缺血低氧

2、的損害造成神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，成為癡呆等疾病的主要病理基礎。新近研究表明，新生及成年哺乳動物與人的海馬區(qū)域存在著神經(jīng)發(fā)生（神經(jīng)干細胞，neural stem cell，NSC），為人們深入研究海馬功能及防治缺血性神經(jīng)疾病提供了新的研究途徑。血管性癡呆是迄今為止唯一可以預防的癡呆類型，早期積極預防治療具有可逆性。采用針灸促進海馬內(nèi)神經(jīng)發(fā)生向神經(jīng)元方向分化并在腦組織內(nèi)整合，對海馬神經(jīng)可塑性進行調(diào)節(jié)，改善學習記憶功能，無疑對VD的基礎與臨床研究具有重大意義。干細胞是當前生命科學的研究熱點，Science將干細胞研究評為21世紀最重要的十項研究領域之首，為世人矚目。正是因為干細胞的特殊科學意義及

3、其在醫(yī)學上的應用前景，世界各國對此都投入大量的人力、財力進行有關(guān)基礎和應用的研究。隨著我省經(jīng)濟的發(fā)展，人民生活水平的提高，老年人口不斷增加，而老年期癡呆、腦血管病等重大疾病也因之而增多。從新的思路研究這些疾病的發(fā)病機理和探索有效治療方法，勢必為提高我省人口健康水平有積極的促進作用。本項目的研究也正是基于理念而申請的立項的。2、項目研究目標及與申請者研究工作長期目標的關(guān)系2.1 研究目標開展對實驗性VD大鼠的發(fā)病機理研究，證實海馬的神經(jīng)發(fā)生障礙是血管性癡呆的病理基礎。進行電針對擬VD大鼠的治療觀察，在肯定療效的基礎上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學的研究理論與技術(shù)，深入探討針灸治療血管性癡呆的海馬神經(jīng)發(fā)生作用機制

4、。2.2 與申請者研究工作長期目標的關(guān)系申請者長期從事針灸治療缺血性腦血管疾病的臨床與作用機制研究，特別是對針刺治療缺血性腦血管病的臨床與實驗有較深入的研究。申請者設計并實施完成2003年度廣東省自然科學基金“電針對局灶性腦缺血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞影響的研究”（No.31458，排名第二）；參與完成國家自然科學基金“針刺對局灶性腦缺血后突觸可塑性促進作用的研究”（No.30271644，排名第五）和國家中醫(yī)藥管理局科研基金“針刺調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子對缺血后腦可塑性促進作用的研究”（No.02-03JP36，排名第五）等項目。這為開展本項目的研究在相關(guān)技術(shù)和實驗經(jīng)驗等方面提供了有力的支持。在上述研究

5、基礎上，本項目擬通過電針調(diào)節(jié)神經(jīng)誘導因子Noggin基因的表達以調(diào)控VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生機制，探討針灸治療VD的作用機理，為探索新的臨床治療方法、提高療效，提供具有指導價值的科學依據(jù)。3、項目研究內(nèi)容，研究方案和進度安排3.1 研究內(nèi)容本項目從中西醫(yī)結(jié)合基礎的角度，研究針刺治療VD的海馬神經(jīng)發(fā)生機制，從調(diào)節(jié)腦與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)的神經(jīng)誘導因子Noggin基因的表達為切入點，觀察VD及電針治療時海馬神經(jīng)發(fā)生的變化規(guī)律，新生神經(jīng)細胞的增殖、遷移與分化，結(jié)合相應神經(jīng)行為學的改變應用透射電鏡從體視學角度證實其功能性突觸的重建，探討Noggin等在治療VD時對神經(jīng)發(fā)生的影響作用。旨在闡明針灸治療VD的神經(jīng)

6、生物學作用機制，為針灸治療缺血性腦血管疾病提供科學依據(jù)。具體如下：1）觀察VD大鼠造模后Noggin基因的表達情況，海馬神經(jīng)細胞丟失及病理形態(tài)學變化情況及齒狀回（DG）神經(jīng)發(fā)生的規(guī)律，電針治療后三者的變化情況：a造模后不同時相Noggin的表達情況及電針干預后的變化；b造模后不同時相海馬神經(jīng)細胞丟失的情況與VD大鼠神經(jīng)行為學及齒狀回LTP之間的關(guān)系；c造模后不同時相海馬齒狀回（DG）新生神經(jīng)細胞的變化規(guī)律及電針干預對其影響；d造模及電針干預不同時相上VD大鼠神經(jīng)行為的變化及LTP的誘導情況。2）在上述研究工作的基礎上，分析電針治療VD的可能的作用機制：a研究腦與神經(jīng)發(fā)育的神經(jīng)誘導因子Noggi

7、n與海馬神經(jīng)發(fā)生（增殖、遷移、分化及功能性突觸的形成）的關(guān)系；b研究大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生情況與VD神經(jīng)行為學及CA3神經(jīng)突觸重建情況的內(nèi)在關(guān)系；c證實電針治療VD大鼠的機制是否通過影響海馬神經(jīng)發(fā)生而發(fā)揮作用。3.2 研究方案動物模型健康雄性老齡SD大鼠（1215個月），體重350500g。經(jīng)Y-迷宮訓練篩選后選擇學習記憶成績合格大鼠，按照Ohta等方法（Ohta H, et al. Brain Res, 1994; 653(1):231-234）永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈制作2-VO慢性腦灌注不足的擬VD模型。根據(jù)研究要求進行動物隨機分組。部分動物進行假手術(shù)，用于對照研究。治療與干預方法電針干預：采用

8、督脈腧穴百會、大椎，采用毫針（1寸，30）針刺接通電針治療儀（G6805型）給予疏密波刺激（刺激參數(shù)：電流強度1mA，頻率：515Hz/s，時間：20min）。部分實驗中采用軀干背部肌肉豐厚處非穴點進行對照，以觀察穴位的相對特異性；在動物造模后，每日電針治療1次，分別連續(xù)給予治療3d、1w、2w、3w、4w及8w。陽性藥物對照（對部分VD模型進行對照）：改善腦循環(huán)藥物：尼莫地平（12mg/kg，灌胃）。在動物造模后每日給藥1次，分別連續(xù)給藥3d、1w、2w、3w、4w及8w。Noggin反義mRNA側(cè)腦室注射：以烏拉坦腹腔麻醉大鼠固定于腦立體定位儀上，根據(jù)Pellegrino圖譜，于側(cè)腦室（A

9、P:1.0, L: 1.5, H: 3.0）埋置不銹鋼導管（外徑0.7 mm，內(nèi)徑0.4 mm），以牙托粉固定于顱骨上，術(shù)后3 d 開始實驗。進行側(cè)腦室內(nèi)注射時，將清醒大鼠固定于敞式裝置上，在埋植的導管內(nèi)插入注射內(nèi)管，其下端超出套管0.5mm，另一端經(jīng)塑料管與微量進樣器連接，取反義寡核苷酸20µg/d（上海生工合成），按組別不同時間每日一次連續(xù)注射，每次注射時間不少于2 min。實驗結(jié)束后，注入2 %滂胺天藍（ Pontamine sky blue），核對給藥部位。指標檢測與關(guān)鍵技術(shù)說明神經(jīng)行為學觀察：aY型電迷宮檢查：用MG-2Y型電迷宮（刺激電壓：50V，延遲2s）篩選成績合格動

10、物。bMorris水迷宮檢查：實驗包括：定位航行實驗：觀察記錄逃避潛伏期和游泳路徑（搜索策略）?？臻g探索實驗：觀察規(guī)定時間內(nèi)大鼠在池中的游泳路徑（搜索策略）。腦組織取材：根據(jù)檢測內(nèi)容的不同，分別采用斷頭處死取腦和經(jīng)心灌注固定取腦，HE及Nissl染色采用石蠟包埋切片，組化染色及原位雜交采用冰凍切片。原位雜交觀測Noggin 在大鼠腦內(nèi)的表達與分布：參照文獻（蔡文琴，等實用免疫細胞化學與核酸分子雜交技術(shù)四川科學技術(shù)出版社，1994354-432）采用漂浮法進行Noggin mRNA 原位雜交組織化學染色（Noggin 基因的cRNA 核酸探針，購自華美生物制劑公司；地高辛標記試劑盒抗地高辛抗體、

11、堿性磷酸酶顯色劑NBT/ BCIP均購自Rhoe 公司）。步驟簡述：胃蛋白酶K37孵育、地高辛標記的探針42反應，堿性磷酸酶標記抗地高辛抗體孵育，用NBT/BCIP顯色，脫水、裱片、DPX封片。RT-PCR半定量檢測Noggin的表達：分別取各組大鼠5只。海馬總RNA提取按文獻方法（Sambrook J, et al. Molecular cloning, a laboratory manualM. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press USA,1989.343-362）進行。PCR上、下游引物，通過網(wǎng)站（www.genome.wi. mit

12、.edu）提供的引物設計程序（Primer 3.0）設計。反應液經(jīng)96.63min 預變性后，9460s、5560s、7260s循環(huán)30 次，反應產(chǎn)物置2瓊脂糖凝膠電泳，攝片，掃描半定量分析。免疫組化等方法觀察海馬神經(jīng)發(fā)生情況：aBrdU標記方法：在大鼠處死的前3天開始，進行BrdU腹腔注射50mg/kg，每12h一次，連續(xù)注射4次，在最后一次注射后24h處死，進行各項指標檢測。bBrdU組化染色前切片中DNA解鏈和變性的預處理：50formamide（甲酰胺）/2×SSC中，置于64孵育箱，30min，入2N HCl中，37孵育30min，其余漂洗過程略。cBrdU免疫組化染色方法

13、觀察海馬細胞增殖情況：參照Okano等的方法（Okano HJ, et al. Dev Neurosci, 1996, 18: 199- 209）及BrdU（2351，Sigma公司）染色說明書方法加以改進，采用ABC法進行BrdU免疫組化漂浮染色。d免疫熒光雙重標記及熒光顯微鏡觀察海馬神經(jīng)干細胞的增殖遷移、分化及與Noggin受體共表達情況：用雞尾酒法染色，首先切片與小鼠抗BrdU單克隆抗體孵育，繼之用Cy3標記的羊抗鼠抗體處理；入兔抗GFAP（Sigma公司）或兔抗TuJl（Sigma公司）、兔抗Noggin受體抗體（Lab Vision公司）孵育，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔抗體孵育，甘油封片，

14、熒光顯微鏡下觀察計數(shù)、拍照成像。HE染色及Nissl染色觀測海馬病理形態(tài)及神經(jīng)元丟失情況。透射電鏡（突觸體視學）觀察海馬CA3區(qū)神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)變化及電針對其影響：按照Freddari方法（Freddari B, et al. Brain Res, 1993;628:193），計算突觸的數(shù)量和突觸連接帶與測試線的交點數(shù)，定量分析突觸的突觸數(shù)密度；再以XY-生物圖像分析儀對突觸界面曲率、突觸后致密物質(zhì)等進行定量分析。機制探討觀察電針對VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響a在模型建立后及電針干預的不同時相分別給予BrdU在體標記增殖細胞，采用免疫組化染色法觀測電針對海馬神經(jīng)發(fā)生的全過程影響。b用BrdU + P

15、SA-NCAM（多聚唾液酸化神經(jīng)細胞黏附因子）對增殖細胞進行免疫雙重熒光標記，采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察電針對增殖細胞的遷移和突觸形成的影響。c用BrdU + GFAP（GFAP，膠質(zhì)纖維酸性蛋白，膠質(zhì)細胞標記物），BrdU + TuJ1（-tubulin，早期未成熟神經(jīng)元的標記物）或NeuN（神經(jīng)細胞核抗原，成熟神經(jīng)元標記物）對增殖細胞進行免疫熒光雙重標記，采用熒光顯微鏡觀察電針對增殖細胞分化的影響。通過側(cè)腦室注射外源性Noggin mRNA反義寡核苷酸或Noggin因子受體抗體，觀察神經(jīng)發(fā)育誘導因子在電針治療VD中對海馬神經(jīng)發(fā)生的影響。應用RT-PCR技術(shù)對造模后和電針治療不同時相上海馬

16、內(nèi)Noggin的表達進行半定量分析，觀察電針干預對Noggin表達的影響。采用免疫組化和原位雜交技術(shù)，觀察神經(jīng)發(fā)育誘導因子與新生神經(jīng)細胞的分布與共存情況。采用透射電鏡技術(shù)，觀察VD模型與電針干預在不同時相上海馬CA3區(qū)結(jié)合神經(jīng)行為學觀察情況證實突觸的形成。統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，用SPSS12. 0 統(tǒng)計軟件包進行方差分析，兩樣本均數(shù)間比較用t 檢驗，P < 0. 05 有統(tǒng)計學意義。技術(shù)路線示意附：技術(shù)路線示意實驗一：電針對擬VD大鼠的治療效應及對VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生、Noggin的影響模型4w組Y迷宮篩選老齢大鼠180只電針3d組模型3d組電針7d組模型7d組電

17、針2w組模型2w組電針3w組模型3w組電針8w組電針4w組模型8w組在缺血后不同時相進行BrdU在體標記在不同時相行神經(jīng)行為學觀察后，按要求處死動物取材治療效應等觀察：神經(jīng)行為學觀察；HE及Nissl染色觀察病理改變及神經(jīng)元丟失情況；透射電鏡觀察海馬CA3突觸可塑性等。海馬神經(jīng)發(fā)生等觀察：免疫組化單標及雙標染色觀察NSC的增殖、遷移與分化，以及Noggin受體與新生細胞共表達情況；Noggin mRNA的RT-PCR檢測；原位雜交觀察Noggin分布等。造模，隨機分組，每組15只綜合分析得出結(jié)論實驗二：Noggin對擬VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生和電針干預過程中治療效應的影響模型4w組Y迷宮篩選老齢大

18、鼠180只電針3d組模型3d組電針7d組模型7d組電針2w組模型2w組電針3w組模型3w組電針8w組電針4w組模型8w組在缺血后給予側(cè)腦室注射反義Noggin mRNA，缺血后不同時相進行BrdU在體標記在不同時相行神經(jīng)行為學觀察后，按要求處死動物取材治療效應等觀察：神經(jīng)行為學觀察；HE及Nissl染色觀察病理改變及神經(jīng)元丟失情況；透射電鏡觀察海馬CA3突觸可塑性等。海馬神經(jīng)發(fā)生等觀察：免疫組化單標及雙標染色觀察NSC的增殖、遷移與分化，以及Noggin受體與新生細胞共表達情況；Noggin mRNA的RT-PCR檢測；原位雜交觀察Noggin分布等。造模，隨機分組，每組15只綜合分析得出結(jié)論

19、3.3 進度安排第一年度（2006.1-2006.12）觀察造模后及電針干預下VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的變化規(guī)律，以及針灸治療效應：具體包括：建立擬VD模型，觀察VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的改變情況（增殖、遷移、分化）及電針干預對其影響；觀察電針治療效應（神經(jīng)行為學及海馬病理改變，突觸可塑性（透射電鏡）的變化等）。第二年度（2007.1-2007-12）闡明腦與神經(jīng)發(fā)育誘導因子Noggin基因的表達對VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響作用：通過側(cè)腦室注射給予外源性Noggin 反義mRNA，觀察Noggin對大鼠VD 模型及電針干預后海馬神經(jīng)發(fā)生的影響；在造模和電針治療不同時相上觀察海馬內(nèi)Noggin的表達分布

20、情況并進行半定量分析，觀察電針干預對Noggin表達的影響；采用免疫組化染色或原位雜交技術(shù)，觀察神經(jīng)發(fā)育誘導因子Noggin與新生神經(jīng)細胞的分布與共存情況。第三年度（2008.1-2008.12）觀察新生神經(jīng)細胞的分化情況及功能性突觸的建立，結(jié)合前述的研究結(jié)果揭示電針治療VD的作用機制：對增殖細胞進行免疫熒光雙重標記，采用熒光顯微鏡觀察電針對增殖細胞分化的影響。在觀察細胞分化情況的基礎上，結(jié)合神經(jīng)行為學及電鏡的突觸體視學研究情況，以證實新生神經(jīng)元功能性突觸的建立與形成。綜合所有研究結(jié)果，對電針在治療VD大鼠中對海馬神經(jīng)發(fā)生機制的影響作用進行分析，得出研究結(jié)論。根據(jù)研究工作的進展情況，可適當調(diào)整

21、上述實驗或穿插結(jié)合。4、項目創(chuàng)新之處4.1項目創(chuàng)新之處創(chuàng)見性地提出“海馬的神經(jīng)發(fā)生障礙是血管性癡呆的病理基礎，針灸治療VD的可能是促進了海馬神經(jīng)發(fā)生機制而發(fā)揮作用”的研究假說，并通過實驗研究加以證實。采用國際通用的VD大鼠模型，從神經(jīng)發(fā)生的角度，系統(tǒng)觀察血管性癡呆的發(fā)病及電針治療后海馬神經(jīng)發(fā)生的變化規(guī)律，為深入揭示這一復雜疾病的發(fā)病機制做出積極的貢獻。本研究通過電針調(diào)節(jié)神經(jīng)誘導因子Noggin基因的表達以調(diào)控VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生機制，探討針灸治療VD的作用機理，為探索新的臨床治療方法、提高療效，提供具有指導價值的科學依據(jù)。4.2項目立題依據(jù)在分析卒中后癡呆發(fā)生的重要危險因素中發(fā)現(xiàn)：缺血低氧性病

22、變是卒中后癡呆發(fā)生的主要危險因素。海馬是目前公認與學習、記憶等高級神經(jīng)功能活動具有密切關(guān)系的重要腦區(qū)，而海馬最易受缺血低氧的損害造成神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，成為癡呆等疾病的主要病理基礎。影像學定量MRI研究認為，VD患者中存在海馬或海馬杏仁體復合體萎縮，推測是由缺血性損害所致2。Fein等3認為，皮質(zhì)下缺血性血管性癡呆與海馬及皮質(zhì)萎縮有關(guān)，與腔隙性梗死的數(shù)目、部位、體積無關(guān)；且海馬萎縮是病變嚴重程度最好的預測指標。隨著神經(jīng)科學的發(fā)展，人們認識到成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）仍能不斷地產(chǎn)生新的神經(jīng)元，即在成年CNS仍有神經(jīng)發(fā)生（neurogenesis

23、）。大量證據(jù)表明，大腦終生具有神經(jīng)再生的能力，而新生神經(jīng)元可能具有拓展和修復學習記憶的重要功能4-6。目前，在成年哺乳動物腦內(nèi)，人們了解比較多的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域有兩個，即海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）的顆粒下層（subgranular zone，SGZ）和側(cè)腦室的腦室下層（subventricular zone，SVZ）。成年海馬DG存有神經(jīng)干細胞或神經(jīng)元前體細胞，具有長期自我更新能力，是海馬新生神經(jīng)元的主要來源7,8。成年海馬神經(jīng)發(fā)生已在不同種屬間得到了廣泛證明，表明成年海馬神經(jīng)發(fā)生在種屬間高度保守，是生物界的普遍現(xiàn)象。學習記憶是大腦的高級功能。長期以來，已從眾多角度對其機制進行

24、了探討，但有關(guān)學習記憶的機制研究仍未取得突破性進展。研究表明，成年動物海馬新生細胞絕大多數(shù)具有成熟神經(jīng)元的形態(tài)，且能夠產(chǎn)生動作電位并形成功能性突觸聯(lián)系9。這些NSC經(jīng)過遷移到達顆粒細胞層，發(fā)出的樹突進入海馬的分子層，它們的軸突則成為苔蘚纖維通路的一部分，并與CA3區(qū)的靶神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系。CA3區(qū)是海馬產(chǎn)生長時程增強（long-term potentiation，LTP）的主要部位，因而位于SGZ的神經(jīng)發(fā)生對空間學習與記憶可能有重要作用。成年海馬的神經(jīng)發(fā)生與學習記憶密切相關(guān)。海馬新生的神經(jīng)元可能參與記憶的形成與保存，一些促進成年海馬神經(jīng)發(fā)生的因素往往能夠改善學習記憶功能，而抑制海馬神經(jīng)發(fā)生的因

25、素可出現(xiàn)學習記憶等功能障礙10。Shors等5證明新生神經(jīng)元對大鼠海馬依賴型記憶（hippocampal-dependent memory）的形成不可或缺。研究用藥物殺死增殖的細胞，發(fā)現(xiàn)新生神經(jīng)元數(shù)目減少時導致海馬依賴型記憶嚴重受損；停藥后細胞增殖恢復，海馬依賴型記憶明顯改善。整個實驗過程中，海馬非依賴型記憶未受任何影響，成熟的海馬神經(jīng)元沒有死亡，海馬CA1區(qū)也未發(fā)生永久的神經(jīng)生理學性質(zhì)的改變。這些研究表明，海馬新生神經(jīng)元是相關(guān)學習記憶所必需。海馬是腦組織對缺血高度敏感的腦區(qū)。缺血性腦損傷極易造成神經(jīng)元丟失而導致腦功能缺陷11。Yagita等12發(fā)現(xiàn)，短暫性前腦缺血后，SGZ內(nèi)增殖細胞的數(shù)量增

26、加5.78倍，4周后大約70%表達神經(jīng)元的表型，表明缺血可誘導海馬內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生。Iwai等13對短暫性全腦缺血后DG神經(jīng)發(fā)生過程中細胞增殖、遷移和分化的關(guān)系進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血后齒狀回NSC的增殖開始于SGZ，然后遷移到顆粒細胞層并在此分化成神經(jīng)元，另一部分新生細胞移行至DG門區(qū)分化為膠質(zhì)細胞，而這三步主要在全腦短暫性缺血后2個月內(nèi)完成。Nakatomi等6也觀察到，在缺血性損傷腦組織，給予適當刺激和生長因子，則能誘導海馬的NSC增殖分化成新的神經(jīng)元，從而改善學習記憶能力。oggin與海馬神經(jīng)發(fā)生的關(guān)系近幾十年來研究者致力于神經(jīng)誘導因子（Neural inducing facror，NI

27、F）的尋找，目前已發(fā)現(xiàn)的NIF有Noggin、follistatin和chordin。其神經(jīng)誘導作用可能是通過阻斷骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）而發(fā)生14。實驗表明，抑制BMPs信號就足以導致神經(jīng)的發(fā)生15。所以目前研究認為：神經(jīng)發(fā)生不是一個主動誘導的過程，而是阻斷向表皮誘導信號BMPs而產(chǎn)生的內(nèi)定過程。研究發(fā)現(xiàn)Noggin對神經(jīng)發(fā)生有重要影響作用，腦缺血后的神經(jīng)再生也可能與Noggin的參與有關(guān)。Noggin是由室管膜細胞產(chǎn)生一種能與BMPs結(jié)合并抑制BMPs受體激活的多肽，它能通過抑制內(nèi)源性BMPs信號通路而促進海馬神經(jīng)再生，同時抑制NSC向

28、膠質(zhì)細胞分化16。研究發(fā)現(xiàn)，從胚胎至成年的整個發(fā)育期，腦室下區(qū)均有Noggin與BMPs表達，且Noggin與BMPs之間的平衡對室下區(qū)NSC的增殖、分化、存活及新生神經(jīng)元可塑性均有重要調(diào)控作用17。室下區(qū)細胞主要表達BMPs及其相應受體，而相鄰的室管膜細胞則主要表達Noggin。BMPs通過促進膠質(zhì)細胞的分化而抑制神經(jīng)發(fā)生，而外源性Noggin蛋白則促進神經(jīng)發(fā)生18。近年研究表明，Noggin基因作為重要的NIF表達在成年大鼠海馬與前皮質(zhì)，并與空間學習記憶密切相關(guān)。由海馬參與的Morris水迷宮訓練能使海馬DG的顆粒細胞層、CA3區(qū)及前皮質(zhì)內(nèi)Noggin mRNA陽性細胞數(shù)顯著升高，側(cè)腦室注

29、射Noggin反義寡核苷酸可明顯抑制該效應，并可引起大鼠空間學習記憶障礙，表現(xiàn)為空間記憶的獲得困難和形成記憶的保留障礙19。目前，VD尚沒有肯定的藥物或手術(shù)治療方法。預防中風被認為是減少VD發(fā)病率和死亡率最直接和實質(zhì)性的方法。常用的治療藥物有血液流變學藥物（己酮可可堿）、抑制細胞鈣內(nèi)流血管活性藥物（尼莫地平）、阿司匹林、丙戊茶堿、納洛酮及核苷嘧啶等。最近更多提到的乙酰膽堿酯酶抑制劑被推薦為治療VD的首選藥物。但上述藥物均存在著一定的毒副作用。采用針灸尤其是電針治療VD有著良好的療效，最近，彭唯娜等20對國內(nèi)外關(guān)于電針治療VD的文獻中符合隨機對照試驗的臨床研究，篩選出符合納入標準的5個研究采用循

30、證醫(yī)學的方法進行了系統(tǒng)評價，電針治療組有效率在7091之間，療效均優(yōu)于西藥對照組。其評價結(jié)果顯示：電針治療VD安全、無不良反應，對改善整體功能和認知功能均較對照組有效，其中電針對整體功能改善的有效性較好。VD屬于中醫(yī)學“呆病”、“郁癥”等范疇。病位在腦，病機主要為氣血虧虛，肝腎不足，腦竅失于榮養(yǎng)，進而髓海失聰所致。靈樞·海論提出：腦為髓之海，其輸上在于華蓋（百會），下在風府。難經(jīng)·二十八難云：“督脈者上至風府，入屬于腦。”百會與大椎均為督脈穴位，督脈與腦密切相關(guān)，百會為“三陽五會”，大椎為“諸陽之會”，針刺此兩穴可以激發(fā)經(jīng)氣、疏通經(jīng)絡，使腦髓得氣血之榮養(yǎng)而復聰。我們以往的研

31、究以大椎、百會為主從臨床和實驗兩個方面均證實電針可有效改善VD患者的癥狀、提高實驗動物學習記憶的能力。海馬在許多記憶過程中起重要作用，包括空間學習、對環(huán)境中物體的方位進行定位及將不連續(xù)的信息連接起來，這些功能的發(fā)揮可能與海馬中大量新生神經(jīng)元的出現(xiàn)及新突觸的形成有關(guān)21。我們以往證實22,23：電針可促進腦缺血后內(nèi)源性NSC的增殖和分化，電針治療缺血性腦損傷的主要作用機制之一可能是通過激發(fā)NSC參與腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的重塑自身修復而實現(xiàn)的。大量的實驗研究表明Noggin拮抗BMPs促進成年海馬與SVZ的神經(jīng)發(fā)生。Noggin作為一種重要的神經(jīng)誘導劑，在神經(jīng)發(fā)生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究成年海馬

32、神經(jīng)發(fā)生在電針治療VD的作用機制，通過Noggin調(diào)控海馬的神經(jīng)發(fā)生參與學習記憶，將是針刺治療VD機理研究的一個嶄新領域。綜上所述，本項目擬從中西醫(yī)結(jié)合基礎的角度，研究電針督脈腧穴百會、大椎治療VD的海馬神經(jīng)發(fā)生機制，從調(diào)節(jié)腦與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)的神經(jīng)誘導因子Noggin基因的表達入手，觀察VD及電針治療時海馬神經(jīng)發(fā)生的變化規(guī)律，新生神經(jīng)細胞的增殖、分化，結(jié)合學習記憶的形態(tài)學基礎神經(jīng)突觸的重建，以及相應神經(jīng)行為學的改變，探討Noggin等在治療VD時對神經(jīng)發(fā)生的促進作用。旨在闡明針灸治療VD的神經(jīng)生物學作用機制，為治療缺血性腦血管疾病提供科學依據(jù)。5、工作基礎與工作條件5.1 工作基礎本課題組主

33、要成員長期從事針灸治療缺血性腦血管病、VD、帕金森病的臨床和實驗研究，特別是對針刺治療缺血性腦血管病的臨床與實驗有較深入的研究。曾參與完成國家自然科學基金“針刺對局灶性腦缺血后突觸可塑性促進作用的研究”和國家中醫(yī)藥管理局科研基金“針刺調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子對缺血后腦可塑性促進作用的研究”等項目。本課題申請者，在攻讀博士學位期間以廣東省自然科學基金項目“電針對局灶性腦缺血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞影響的研究”（No.31458，排名第二）；作為學位研究課題，研究證實：電針可促進腦缺血后內(nèi)源性NSC的增殖和分化，內(nèi)源性NSC參與了缺血新性損傷的腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能重塑自身修復。這為開展本項目的研究在相關(guān)技術(shù)和實驗

34、經(jīng)驗等方面提供了有力的支持。課題組主要成員，自1990年代起以大椎、百會等穴位為主從臨床和實驗兩個方面均證實電針可有效改善VD患者的癥狀、提高實驗動物學習記憶的能力；并證實其作用可能機制是多途徑的。在上述研究基礎上取得了多項相關(guān)研究成果：“電針對局灶性腦缺血大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸受體的調(diào)節(jié)作用”，2004年獲浙江省科技進步二等獎；“腦靶向督脈導入Hup-A傳遞系統(tǒng)及改善癡呆動物記憶障礙研究”， 2003年獲浙江省科技進步二等獎；“電針治療血管性癡呆的實驗研究”獲2003年浙江省教育廳科技進步二等獎。且有在研相關(guān)課題浙江省自然基金項目“電針改善大腦學習記憶與NMDA受體NR2B亞單位的關(guān)系”（No

35、.M303725）。上述研究與所取得的成果，為本課題的研究開展打下良好的工作基礎。5.2 工作條件本校有設施完備的動物實驗中心（提供清潔級實驗大鼠和全封閉清潔級實驗環(huán)境）、我系針灸研究所擁有分子生物實驗室、免疫組織化學實驗室及電生理實驗室，且已經(jīng)具有以下主要儀器設備：PCR擴增儀（美國P-E公司），電泳儀、酶標儀，GIS-2009凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能公司），WDT2腦立體定位儀（中國西北光電公司），CM-1850恒溫冰凍切片機（德國Leica公司），Leica-2025石蠟切片機（德國Leica公司），E-MALL-200圖像采集和分析采用病理圖像分析系統(tǒng)（北京航空航天大學圖像分析系統(tǒng)，

36、3.0版），-80超低溫冰箱（美國克林納特公司），MPF-66型熒光分光光度儀（美國P-E公司），VV-260紫外吸光光度儀（日本島津公司），多功能顯微照相系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司），等。所欠缺的主要是購置生化、形態(tài)、免疫組化和分子生物學等實驗所需的各種大量試劑及實驗材料。另外，需要大型儀器如透射電鏡（附屬省中醫(yī)院）的有償使用及個別儀器的更新等經(jīng)費。6、預期研究結(jié)果及其利用研究結(jié)果的計劃和今后發(fā)展的思路6.1 預期研究結(jié)果：研究結(jié)果的形式以公開發(fā)表的論文和研究報告形式體現(xiàn)，通過研究預期得到以下結(jié)果：明確海馬神經(jīng)發(fā)生在及針灸治療VD中的作用； 證實電針促進VD海馬神經(jīng)發(fā)生及新生神經(jīng)元的功能建立的作

37、用；揭示海馬神經(jīng)發(fā)生在VD及針刺治療VD過程中與神經(jīng)發(fā)育誘導因子Noggin基因表達的相互關(guān)系，最終揭示針灸治療VD的作用機理，豐富和完善針灸治療的科學理論基礎。完成以上工作預計在核心期刊發(fā)表論文5篇左右，其中力爭12篇在國際SCI雜志上發(fā)表。通過研究項目的開展，培養(yǎng)研究生23人。6.2 利用研究結(jié)果的計劃和今后發(fā)展的思路在國內(nèi)核心期刊發(fā)表相關(guān)研究成果的論文，并努力將研究成果發(fā)表在SCI雜志上進行發(fā)表，擴大其在國內(nèi)外的影響；爭取獲得省級以上科研成果獎。通過研究，探索VD的病理機制，為針灸和其他方法治療VD及相關(guān)缺血性腦血管疾病探索有效的治療思路和作用機理。國內(nèi)外對神經(jīng)干細胞的研究多集中在體外培

38、養(yǎng)后進行腦內(nèi)移植上，我們的研究是期望發(fā)現(xiàn)針刺調(diào)節(jié)體內(nèi)神經(jīng)誘導因子、營養(yǎng)因子和其它能幫助NSC存活生長的分子信號的最佳方法，進一步激活患者自身的NSC增殖、分化和內(nèi)源性修復機制。這也為本成果的利用和發(fā)展奠定了良好的基礎，可以與NSC移植治療相結(jié)合，促進移植后的NSC存活、增殖和分化而起到有效的治療作用。在本研究的工作基礎上，積極爭取獲得國家自然科學基金和國家重大研究計劃的項目資助；同時也進行廣泛聯(lián)系，與神經(jīng)內(nèi)外科的干細胞移植研究項目相結(jié)合，進行跨學科交叉領域的研究攻關(guān)。7、參考文獻1. Desmond DW, Moroney JT, Paik MC, et al. Frequency and c

39、linical determinants of dementia after ischemic strokeJ. Neurology, 2000; 54(10f):1124-11312. Olsson Y, Brun A, Englund E. Fundamental pathological lesions in Vascular dementia. Acta Neurol Scand Suppl, 1996; 168:31-383. Fein G, Di Sclafani V, Tanabe J, et al. Hippocampal and cortical atrophy predic

40、t dementia in subcortical ischemic vascular disease. Neurology, 2000, 55:1626-16354. Eriksson PS, Perfilieva E, Bjork-Eriksson T, et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Med, 1998; 4:1313-1317 5. Shors TJ, Miesegaes G, Beylin A, et al. Neurogenesis in the adult involved in the for

41、mation of trace memories. Nature, 2001; 410:372-376 6. Nakatomi H , Kuriu T, Okabe S, et al. Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors. Cell, 2002; 110:429-4417. Horner PJ, Gage FH. Regenerating the damaged central nervo

42、us system. Nature, 2000; 407: 963-970 8. Liu S , Wang J , Zhu DY, et al. Generation of functional inhibitory neurons in the adult rat hippocampus. J Neurosci, 2003 ;23 (3) :732-7369. Henriette VP, Alejandro FS, Brian RC, et al. Functional neurogenesis in hippocampus. Nature, 2002; 415:1030-1034.10.

43、Scharff C. Chasing fate and fundion of new neurons in adlut brains.Curr Opin Neurobiol 2000; 10(6): 774-78311. Jin K, Minami M, Lan JQ, et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc Natl Acad Sci USA, 2001; 98 (8): 4710-471512. Yagita Y, Kitagawa K, Ohtsuki T, et al.Neurogenesis by proge