四大類(lèi)微生物菌落形態(tài)的比較和識(shí)別

1、四大類(lèi)微生物菌落形態(tài)的比較和識(shí)別 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：1 熟悉四大類(lèi)微生物菌落的主要特征2 掌握識(shí)別四大類(lèi)微生物菌落形態(tài)的依據(jù)和要點(diǎn)，并應(yīng)用于識(shí)別未知菌落內(nèi)容：1 觀察已知的四大類(lèi)微生物菌落特征2 辨認(rèn)未知的四大類(lèi)微生物菌落特征實(shí)驗(yàn)原理掌握識(shí)別四大類(lèi)微生物菌落形態(tài)的要點(diǎn)對(duì)于從事菌種的篩選、雜菌的識(shí)別和菌種鑒定等項(xiàng)工作都有重要意義。菌落是由某一微生物的少數(shù)細(xì)胞或孢子在固體培養(yǎng)基表面繁殖后所形成的子細(xì)胞群體，因此，菌落形態(tài)在一定程度上是個(gè)體細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)在宏觀上的反映。由于每一大類(lèi)微生物都有其獨(dú)特的細(xì)胞形態(tài)，因而其菌落形態(tài)特征也各異。在四大類(lèi)微生物的菌落中，細(xì)菌和酵母菌的形態(tài)較接近，放線菌和霉

2、菌形態(tài)較相似。菌和酵母菌的異同 細(xì)菌和多數(shù)酵母菌都是單細(xì)胞微生物。菌落中各細(xì)胞間都充滿毛細(xì)管水、養(yǎng)料和某些代謝產(chǎn)物，因此，細(xì)菌和酵母菌的菌落形態(tài)具有尖似的特征，如濕潤(rùn)、較光滑、較透明、易挑起、菌落正反面及邊緣、中央部位的顏色一致，且菌落質(zhì)地較均勻等。它們之間的區(qū)別如下：細(xì)菌：由于細(xì)胞小，故形成的菌落也較小，較薄、較透明且有“細(xì)膩”感。不同的細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生不同的色素，因此常會(huì)出現(xiàn)五顏六色的菌落。此外，有些細(xì)菌具有特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此，在菌落形態(tài)上也有所反映，如無(wú)鞭毛不能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌其菌落外形較圓而凸起；有鞭毛能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌其菌落往往大而扁平，周緣不整齊，而運(yùn)動(dòng)能力特強(qiáng)的細(xì)菌則出現(xiàn)更大、更扁平的菌落，其邊

3、緣從不規(guī)則、缺刻狀直至出現(xiàn)遷居性的菌落，例如變形桿菌屬和菌種。具有莢膜的細(xì)菌其菌落更粘稠、光滑、透明。莢膜較厚的細(xì)菌其菌落甚至呈透明的水珠狀。有芽孢的細(xì)菌常因其折光率和其他原因而使菌落呈粗糙、不透明、多皺褶等特征。細(xì)菌還常因分解含氮有機(jī)物而產(chǎn)生臭味，這也有助于菌落的識(shí)別。酵母菌：由于細(xì)胞較大（直徑約比細(xì)菌大10倍）且不能運(yùn)動(dòng)，故其菌落一般比細(xì)菌大、厚而且透明度較差。酵母菌產(chǎn)生色素較為單一，通常呈礦蠟色，少數(shù)為橙紅色，個(gè)別是黑色。但也有例外，如假絲酵母因形成籍節(jié)狀的假菌絲，故細(xì)胞易向外圈蔓延，造成菌落大而扁平和邊緣不整齊等特有形態(tài)。酵母菌因普遍能發(fā)酵含碳有機(jī)物而產(chǎn)生醇類(lèi)，故其菌落常伴有酒香味。2

4、放線菌和霉菌的異同放線菌和霉菌的細(xì)胞都是絲狀的，當(dāng)生長(zhǎng)于固體培養(yǎng)基上時(shí)有營(yíng)養(yǎng)菌絲（或基內(nèi)菌絲）和氣生菌絲的分化。氣生菌絲向空間生長(zhǎng)，菌絲之間無(wú)毛細(xì)管水，因此菌落外觀呈干燥、不透明的絲狀、絨毛狀或皮革狀等特征。由于營(yíng)養(yǎng)菌絲伸入培養(yǎng)基中使菌落和培養(yǎng)基連接緊密，故菌絲不易被挑起。由于氣生菌絲、孢子和營(yíng)養(yǎng)菌絲顏色不同，常使菌落正反面呈不同顏色。絲狀菌是以菌絲頂端延長(zhǎng)的方式進(jìn)行生長(zhǎng)的，越近菌落中心的氣生菌絲其生理年齡越大，也越早分化出子實(shí)器官或分生孢子，從而反映在菌落顏色上的變化，一般情況下，菌落中心的顏色常比邊緣深。有些菌的氣生菌絲還會(huì)分泌出水溶性色素并擴(kuò)散到培養(yǎng)基中而使培養(yǎng)基變色。有些菌的氣生菌絲在

5、生長(zhǎng)后期還會(huì)分泌滴，因此，在菌落上出現(xiàn)“水珠”。放線菌：放線菌屬原核生物，其菌絲纖細(xì)，生長(zhǎng)較慢，氣生菌絲生長(zhǎng)后期逐漸分化出孢子絲，形成大量的孢子，因此菌落較小，表面呈緊密的絨狀或粉狀等特征。由于菌絲伸入培養(yǎng)基中常使菌落邊緣的培養(yǎng)基呈凹狀。不少放線菌還產(chǎn)生特殊的土腥味或冰片味。霉菌：霉菌屬真核生物，它們的菌絲一般較放線菌粗（幾倍）且長(zhǎng)（幾倍至幾十倍），其生長(zhǎng)速度比放線菌快，故菌落大而疏松或大而緊密。由于氣生菌絲會(huì)形成一定形狀、構(gòu)造和色澤的子實(shí)器官，所以菌落表面往往有肉眼可見(jiàn)的構(gòu)造和顏色。根據(jù)上述特征可將四大類(lèi)微生物菌落的識(shí)別要點(diǎn)歸納如下：三、實(shí)驗(yàn)材料和用具已知菌落：細(xì)菌類(lèi)（大腸桿菌、金黃色葡萄球

6、菌、枯草桿菌）  酵母（釀酒酵母）  放線菌類(lèi)（細(xì)黃鏈霉菌）  霉菌類(lèi)（產(chǎn)黃青霉、黑曲霉、黑根霉）未知菌落 試劑：培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基和高氏1 號(hào)培養(yǎng)基）四、操作步驟1制備已知菌的單菌落通過(guò)平板劃線法獲得細(xì)菌、酵母菌和放線菌的單菌落。用三點(diǎn)接種法獲得霉菌的單菌落。細(xì)菌平板放37恒溫培養(yǎng)2448小時(shí)。酵母菌平板置28培養(yǎng)23天。霉菌和放線菌置28培養(yǎng)57天。待長(zhǎng)成菌落后，觀察并記錄四大類(lèi)微生物菌落的形態(tài)特征。       2制備未知菌的菌落特征   

7、0; 從環(huán)境檢測(cè)所獲得的平板，挑取若干個(gè)菌落，逐個(gè)編號(hào)，作為識(shí)別四大類(lèi)用的未知菌落。3辨別未知菌落1.  區(qū)分“干”或“濕”：根據(jù)菌落是“干”或“濕”及菌落正反面顏色、中央與邊緣顏色是否一致，首先判斷某未知菌落是屬于細(xì)菌、酵母菌類(lèi)，還是屬于放線菌、霉菌類(lèi)。 2.  細(xì)分菌落：根據(jù)上述要點(diǎn)進(jìn)一步區(qū)分未知菌落是屬于四大類(lèi)中的哪一類(lèi)菌，并將判斷結(jié)果填入下表中。 3. 結(jié)果記錄 （一）菌落形態(tài)特征的描述1細(xì)菌菌落的描述菌落表面形態(tài)：有光滑、皺褶、放射狀、根狀等菌落邊緣形態(tài)：有整齊、波狀、絲狀、鋸齒狀、裂葉狀等形態(tài)菌落隆起形態(tài)：有扁平、隆起、草帽狀、膠狀等透明度：可分為秀明、半透明、

8、不透明等2酵母菌菌落形態(tài)的描述：可參照細(xì)菌3放線菌和霉菌菌落的描述：菌落表面的形態(tài)：粗糙、同心圓、輻射狀溝紋、粉狀、絨毛狀或皮革狀等。菌落顏色：菌落正面顏色（包括氣生菌絲或孢子顏色）；菌落反面顏色（指營(yíng)養(yǎng)菌絲顏色）；有否水溶性色素？（色素會(huì)滲入培養(yǎng)基中，使菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基改變顏色）。（二）將已知菌落形態(tài)的觀察和描述記錄于表1中（三）將對(duì)未知菌落的辨別結(jié)果記錄在表2中六、注意事項(xiàng)1每張實(shí)驗(yàn)臺(tái)上各有一套已知菌落和未知菌落，觀察時(shí)請(qǐng)勿隨意搬動(dòng)，以免搞混菌號(hào)。2觀察和判斷菌落大小時(shí)，要注意單菌落在平板上分布疏密的情況，一般菌落密集處勤菌落小，分布稀少的部位菌落大。 表1  

9、;                     已知菌落形態(tài)的觀察記錄 大類(lèi) 菌    名辨 別 要 點(diǎn)       菌    落    描    述   濕  

10、干表面邊緣隆起形狀    顏     色透明度 厚薄 大小 松密 大小 正面 反面 水溶性色素 細(xì)菌大腸 桿菌            金黃色葡萄球       菌            枯草  桿菌    &#

11、160;       酵母菌酵酒  酵母            粘紅  酵母            熱帶  假絲 酵     母          &

12、#160; 放線菌細(xì) 黃 鏈 霉    菌            霉菌青    霉            曲    霉            根  &

13、#160; 霉                     表2                   未知菌落的觀察記錄菌落號(hào)    濕    干  &#

14、160;  菌    落    描    述 判斷結(jié) 果 厚或薄 大或小 松或密 大或小 表面邊緣隆起形狀   顏   色透明度 正面 反面 水溶性色素                         

15、0;                                                 

16、0;                                                    &

17、#160;                    分離的基本方法 微生物分離的方法很多，主要有連續(xù)稀釋分離法，平板劃線分離法和單細(xì)胞分離法等方法。其中，單細(xì)胞分離法需要貴重精密儀器，中學(xué)無(wú)法開(kāi)展，而連續(xù)稀釋分離法和平板劃線分離法卻簡(jiǎn)便易行，中學(xué)完全具備開(kāi)展條件?，F(xiàn)將這兩種方法說(shuō)明如下。 1.連續(xù)稀釋分離法 取1克土樣，在火焰旁放入裝有99毫克無(wú)菌水的錐形瓶?jī)?nèi)，充分搖勻，將菌分散。 用移液管吸取上述菌懸液1毫升，放入盛

18、有9毫升無(wú)菌水的試管中，并進(jìn)一步稀釋成1000倍，即10-3的菌懸液。按10倍稀釋法連續(xù)稀釋到10-8（每1次稀釋?zhuān)柬毟鼡Q移液管）。 取3支1毫升移液管分別從10-8、10-7、10-6菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號(hào)10-8、10-7和10-6的培養(yǎng)皿內(nèi)，同一稀釋液重復(fù)做3個(gè)培養(yǎng)皿。 將溫度為4550的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（其成分和配制方法見(jiàn)本章第三節(jié)）倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28左右），每天觀察培養(yǎng)基表面有無(wú)微生物菌落。 經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落，根據(jù)菌落特征，初步判斷屬于何種類(lèi)型的微生物，并在顯微鏡下檢查，若菌體形

19、態(tài)一致，則可認(rèn)為是初步分離到純菌種。 將分離培養(yǎng)所得的純菌種，從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 2.平板劃線分離法 取1克土樣，在火焰旁加進(jìn)裝有99毫升無(wú)菌水的錐形瓶中，堵塞棉塞，制成菌懸液待用。 取一培養(yǎng)皿置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，左手將培養(yǎng)皿打開(kāi)稍許，向培養(yǎng)皿內(nèi)注入熔化的營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基1012毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使其中的培養(yǎng)基分布均勻，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蠟筆劃分A、B、C、D幾個(gè)區(qū)。應(yīng)連續(xù)制作幾份平板培養(yǎng)基。 將培養(yǎng)皿底部用姆指和無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開(kāi)。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線

20、 67條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過(guò)冷卻的接種針，通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時(shí)，應(yīng)使平板培養(yǎng)基表面向下，以免空氣中雜菌落入。接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。 將劃線后的培養(yǎng)皿倒放在28左右的溫暖處進(jìn)行培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，鑒定微生物類(lèi)群，并根據(jù)鏡檢結(jié)果，判斷是否已分離到了純菌種。如果菌種很純，則可轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)。 連續(xù)稀釋分離法和平板劃線法，均須在無(wú)菌室或接種箱內(nèi)進(jìn)行。 二、各類(lèi)微生物的分離 1.從土壤中分離好氣性及兼性厭氣細(xì)菌 其分離方法見(jiàn)本節(jié)“分離的基本方法

21、” 2.從土壤中分離放線菌 制作高氏一號(hào)培養(yǎng)基，趁熱注入培養(yǎng)皿中，凝成平板，待用。 稱(chēng)取土壤10克，放入裝有100毫升無(wú)菌水的錐形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。振蕩10分鐘，制成10-1菌懸液。按照連續(xù)稀釋分離法，進(jìn)一步制成10-3菌懸液。 用移液管吸取0.1毫升10-3菌懸液，注入平板培養(yǎng)基上，用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整個(gè)培養(yǎng)基上。然后將培養(yǎng)皿倒置于2530溫箱中，培養(yǎng)710天，培養(yǎng)基上會(huì)出現(xiàn)微生物菌落。如果菌落的硬度較大，干燥致密，且與基質(zhì)緊密結(jié)合，不易被針挑起，這就是放線菌菌落。 挑取放線菌菌落，接種于斜面培養(yǎng)基上。 3.從土壤中分離霉菌 制作豆芽汗葡萄糖培養(yǎng)基，并

22、添加80%乳酸數(shù)滴，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。將培養(yǎng)皿中，凝成平板，待用。 稱(chēng)取10克土壤，按上述分離放線菌的方法制成10-4或10-5的菌懸液。 取0.1毫升菌懸液注入培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂抹均勻。然后將培養(yǎng)皿倒置于2530溫箱內(nèi)培養(yǎng)34天。培養(yǎng)基上會(huì)出現(xiàn)微生物菌落。霉菌菌落常長(zhǎng)成絨狀、棉絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀，可根據(jù)這一特征尋找霉菌菌落。 挑取培養(yǎng)皿內(nèi)的霉菌菌落接種于斜面培養(yǎng)基上。 4.從飲水中分離大腸桿菌 制作伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，趁熱注入培養(yǎng)皿中，凝成平板，待用。 用滅過(guò)菌的錐形瓶盛取河水或溝水，按1：10稀釋。 取0.1毫升稀釋液接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上。用平板劃線分離法進(jìn)行分離。 將劃線后的培養(yǎng)皿倒

23、置37溫箱中培養(yǎng)1824小時(shí)。培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)大腸桿菌菌落，菌落中心呈暗藍(lán)黑色，發(fā)金屬光澤。 將菌落接種于斜面培養(yǎng)基上（由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制成）。一、平板劃線分離法 由接種環(huán)以菌操作沾取少許待分離的材料，在無(wú)菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。 二、稀釋倒平板法 先將待分離的材料用無(wú)菌水作一系列的稀釋?zhuān)ㄈ?1 10 、 1 100 、 1 1000 、 1 10000 ），然后分別取不同稀釋液少許，與已溶化并冷卻至 45 左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾

24、入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出出菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。 稀釋涂布法：優(yōu)點(diǎn)：可以計(jì)數(shù)，可以觀察菌落特征。缺點(diǎn)：吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培養(yǎng)基的回收率計(jì)數(shù)！稀釋混合平板法：優(yōu)點(diǎn)：可以計(jì)數(shù)，吸收量為1ml，較方便。優(yōu)點(diǎn)：不能觀察菌落特征。一般用于菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)！平板劃線法：優(yōu)點(diǎn)：可以觀察菌落特征，對(duì)混合菌進(jìn)行分離！缺點(diǎn)：不能計(jì)數(shù)一般用于從菌種的分純！ 

25、涂布法使用較多，但有時(shí)不均勻 稀釋倒平板法操作相對(duì)麻煩，不適合好氧和對(duì)熱敏感的細(xì)菌培養(yǎng) 應(yīng)用范圍：涂布法適用于  好氧菌          稀釋倒平板法適用于厭氧，兼性厭氧菌種的分離 取lmL鹵汁以10倍遞增稀釋方法（一份酸奶，九份無(wú)菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份無(wú)菌水，依次類(lèi)推），將其稀釋至1/1010的-10次冪（我打不上去），然后從不同濃度稀 釋液中分別取lmL傾注在平皿中，再倒入培養(yǎng)基相混合，待培養(yǎng)基凝固后倒置于30C恒溫下 培養(yǎng)48h。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單個(gè)茵落劃線分純，直至純化(茵

26、落單個(gè)大小一致，革蘭氏染色鏡 檢，茵體一致)。結(jié)果分離得到3株不同菌株，分別編號(hào)為菌株1、菌株2、菌株3。再分別轉(zhuǎn)移 到試管斜面上進(jìn)行保存。 分離用培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20g，pH7072 ；保存用斜面培養(yǎng)基：酵母膏1 ，碳酸鈣2 ，葡萄糖1 ，瓊脂2 ，pH 70。 培養(yǎng)條件 將分離出的菌株1、菌株2、菌株3分別接種在上述4種不同的培養(yǎng)基上， 在30?！?恒溫條件下培養(yǎng)48h后觀察并測(cè)定其培養(yǎng)結(jié)果。 測(cè)定方法 菌落總數(shù)采用逐級(jí)稀釋法來(lái)計(jì)數(shù)；pH值用pHS一2C酸度計(jì)測(cè)定；乳酸定性 及含量測(cè)定依據(jù)食品檢驗(yàn)技術(shù) 1I21乳酸菌的分離與篩選的試

27、驗(yàn)程序 自然發(fā)酵酸奶-稀釋-培養(yǎng)-挑起單菌落染色、鏡檢一挑 選革蘭氏陽(yáng)性球菌單菌落一號(hào)培養(yǎng)基一挑選溶鈣圈大的球菌反復(fù)在號(hào)培養(yǎng)基上幾次純化篩選一單菌落優(yōu) 良菌株一試管穿刺低溫保存。 12 12 乳酸菌的鑒定 用光學(xué)顯微鏡、放大鏡進(jìn)行乳酸菌的形態(tài)特征鑒定。生理生化特征鑒定：產(chǎn)乳 酸定性試驗(yàn)乳酸紙層析法0- 、過(guò)氧化氫酶(接觸酶)反應(yīng)、明膠水解反應(yīng) 、硫化氫反應(yīng) 、乳酸菌 發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)型試驗(yàn)0 、耐鹽、酸、溫度試驗(yàn)。 12I3 乳酸菌的保存 采用定期移植低溫保藏法。培養(yǎng)基配方：葡萄糖1 、蛋白胨0 2 、 l(l2PQ|02、瓊脂20、pH值7 0，分裝試管，121。c滅菌30min。將使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后

28、期的細(xì)胞進(jìn)行穿刺 培養(yǎng)，然后密封存于冰箱玲藏室內(nèi)(5qc左右)，2個(gè)月移植1次。 122 分離乳酸菌的生理特點(diǎn)試驗(yàn) 1 2 21 最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定OD值以同溫下不接種培養(yǎng)基作對(duì)照，定期取出接種培養(yǎng)基在721分光光度 計(jì)上，用最大吸收光波長(zhǎng) =6001RIifl測(cè)定。 1222 生長(zhǎng)周期的測(cè)定oD值(方法同上)；pH值：PHB一4pH計(jì)；可滴定酸(以乳酸計(jì))：吸取ImL菌液 加入91L蒸餾水，加入12滴酚酞，用01NNaOH滴定。 12 23 最適pH值的測(cè)試、最適鹽濃度的測(cè)試。 供試樣品及培養(yǎng)基 分離用樣品：酸奶、酸奶及西紅柿均為市售 分離用培養(yǎng)基：BCP培養(yǎng)基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，

29、葡萄糖5g，溴甲酚紫0 04g，瓊脂15g， 蒸槽水lO00ml，pH7 0；MRS培養(yǎng)基見(jiàn)文獻(xiàn) 。 菌種保藏用培養(yǎng)基：脫脂乳培養(yǎng)基：新鮮牛乳離心去掉上層乳脂，下層奶液分裝試管，105 滅菌20mln。 菌利 鑒定用培養(yǎng)基見(jiàn)文獻(xiàn) 6。 1 2 方法 1 2 1 乳酸菌的分離純化 取泡菜汁、酸奶、西紅柿表面洗液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e用傾注法、涂布 法和劃線法在BCP和MRS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行菌種分離。挑取在BCP平板上有透明目的菌落，在 MRS平扳上有溶鈣圈的菌落，反復(fù)純化至純種，挑菌至脫脂牛奶試管中保存 12 2 乳酸菌復(fù)篩對(duì)初篩菌株進(jìn)行革蘭氏染色，保留革蘭氏陽(yáng)性菌株并對(duì)其所產(chǎn)乳酸能力進(jìn) 行定性、定

30、量分析，篩選出產(chǎn)酸高的菌株保存，再把產(chǎn)酸高的菌株經(jīng)蘿l、汁發(fā)酵 】，進(jìn)一步選擇產(chǎn) 酸高、_l】味純正的菌株保存鑒定 1 2 3 乳酸定性測(cè)定果用紙層析法。溶劑系統(tǒng)為乙醇：濃氨水：水=80：5：15，顯色劑為0 04 的溴甲酚紫酒精溶液。層析時(shí)將乳酸、檸檬酸配成1 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液 及乳酸發(fā)酵液 均點(diǎn)樣3 上行層析，顯色與標(biāo)準(zhǔn)樣比較 12 4 乳酸的定量測(cè)定采用氣相色譜法，利用芐酯化法制備乳酸衍生物，將待測(cè)乳酸菌株在產(chǎn) 酸培養(yǎng)基內(nèi)37"C培養(yǎng)3d，離心。取上清液剃備衍生物，氣相色譜分析含量。氣相色譜工作條件為： EGS色譜柱，柱溫160'C，氣化溫度180'17

31、，檢測(cè)器溫度l70"C，載氣為N，。 12 5 菌種鑒定根據(jù)簡(jiǎn)明第八版伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè) 和一般細(xì)菌常用鑒定手冊(cè)6 對(duì)復(fù)篩 出的菌株的形態(tài)、生理生化、碳源利用等方面進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，并提取乳酸菌株DNA，采用熔鏈溫度 .、固體培養(yǎng)基分離1、稀釋倒平板特點(diǎn)：菌落分離較為均勻，進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。但操作相對(duì)麻煩，熱敏感菌有時(shí)易被燙死，而嚴(yán)格好氧菌也可能因被固定在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到影響。2、涂布平板法特點(diǎn)：操作相對(duì)簡(jiǎn)單，是較常使用的常規(guī)方法。但有時(shí)會(huì)因涂布不均勻使某些部位的菌落不能分開(kāi)，進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)時(shí)需對(duì)稀釋和涂布過(guò)程的操作特別注意，否則不易得到準(zhǔn)確的結(jié)果。3、平板劃線法特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，

32、多用于對(duì)已有純培養(yǎng)的確認(rèn)和再次分離。應(yīng)用：這三種方法可用于所有能在固體培養(yǎng)基表面形成菌落的微生物的純培養(yǎng)分離。并且，通過(guò)選用適當(dāng)?shù)倪x擇平板及培養(yǎng)條件，可直接分離各種具有特定生理特征的微生物。和厭氧罐或厭氧手套箱技術(shù)結(jié)合，這3種方法也可用于獲得各種厭氧菌的純培養(yǎng)。4、稀釋搖管法特點(diǎn)：稀釋倒平板法的一種變通形式，但由于菌落形成在瓊脂柱的中間，觀察和挑取都相對(duì)困難。應(yīng)用：在缺乏專(zhuān)業(yè)的厭氧操作設(shè)備的情況下對(duì)嚴(yán)格厭氧菌進(jìn)行分離和觀察。二、液體培養(yǎng)基分離1、稀釋法特點(diǎn)：工作量大，是否獲得純培養(yǎng)需依靠統(tǒng)計(jì)學(xué)的推測(cè)。應(yīng)用：不能或不易在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物進(jìn)行純培養(yǎng)分離或數(shù)量統(tǒng)計(jì)。2、富集培養(yǎng)特點(diǎn)：一般不能

33、直接獲得微生物的純培養(yǎng)，在通過(guò)富集培養(yǎng)使原本在自然環(huán)境中占少數(shù)的微生物的數(shù)量大大提高后，需再通過(guò)平板法進(jìn)行相應(yīng)微生物純培養(yǎng)的分離和檢測(cè)。應(yīng)用：（1）根據(jù)某種微生物的特殊生長(zhǎng)要求，按照意愿從自然界中對(duì)這種微生物進(jìn)行有針對(duì)性的有效分離；（2）分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計(jì)的特定環(huán)境中能生長(zhǎng)的微生物，盡管我們并不知道什么微生物能在這種特定的環(huán)境中生長(zhǎng)。三、顯微操作單細(xì)胞（孢子）挑取特點(diǎn)：分離過(guò)程直觀，可靠，但對(duì)儀器和操作技術(shù)要求較高，多限于高度專(zhuān)業(yè)化的科學(xué)研究。而挑取的微生物單細(xì)胞或孢子需經(jīng)固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后才能獲得其純培養(yǎng)物。應(yīng)用：從樣品中直接分離所需的微生物細(xì)胞或孢子，獲得其純培養(yǎng)。分離純化米曲霉米

34、曲霉菌種里感染了黃曲霉,怎么將米曲霉分離純化出來(lái)?具體方法是什么?怎么檢測(cè)純化完全了? 如果你愿意將你的答案告訴我,請(qǐng)你詳細(xì)點(diǎn),謝謝！實(shí)在不行只有從頭開(kāi)始了。從劃線培養(yǎng)開(kāi)始吧。 單菌落的挑取在10倍系列稀釋的平板中進(jìn)行，選取菌落數(shù)在30300之間的平板，劃線純化方法如下： 對(duì)低于30個(gè)左右菌落的平板，每個(gè)菌落均挑取，劃線純化。 對(duì)50個(gè)左右菌落的平板，挑取1/2菌落劃線純化。 對(duì)100個(gè)左右菌落的平板，挑取特殊的菌落純化。 反復(fù)劃線純化，至菌落形態(tài)和菌株形態(tài)分別完全一致，可認(rèn)為是純菌株。 優(yōu)勢(shì)菌的挑取在浸海2h14d掛片系列稀釋培養(yǎng)平板中進(jìn)行，挑取12株優(yōu)勢(shì)菌落形態(tài)的菌株于2216E平板上劃線

35、純化。 在純化的菌株中加入適量甘油，保存于-80超低溫冰箱中和-23冰箱中。 菌株鑒定 細(xì)菌鑒定按照一般細(xì)菌常用鑒定方法進(jìn)行，將挑取純化的菌株鑒定至屬。鑒定試驗(yàn)包括形態(tài)觀察、革蘭氏染色、鞭毛染色、氧化酶反應(yīng)、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、0/129試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、色素產(chǎn)生試驗(yàn)及發(fā)光現(xiàn)象觀察等項(xiàng)目，參照J(rèn).D.Oliver海洋細(xì)菌鑒定表，將附著細(xì)菌分類(lèi)至屬。 采用硫酸銨沉降法分離純化米曲霉M3所產(chǎn)中性蛋白酶,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究.結(jié)果表明:用硫酸銨沉降法所得粗酶粉的酶活力高達(dá)159781.1u/g;該酶的最適反應(yīng)溫度為50,最適作用pH值為7.5;該酶在30

36、40時(shí)具有良好的熱穩(wěn)定性,在pH值6.57.5的條件下酶是穩(wěn)定的;NH1 4,K1 對(duì)該蛋白酶有明顯的激活作用,Fe3 則對(duì)其表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用. 菌種的分離 取lmL鹵汁以10倍遞增稀釋方法（一份酸奶，九份無(wú)菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份無(wú)菌水，依次類(lèi)推），將其稀釋至1/1010的-10次冪（我打不上去），然后從不同濃度稀 釋液中分別取lmL傾注在平皿中，再倒入培養(yǎng)基相混合，待培養(yǎng)基凝固后倒置于30C恒溫下 培養(yǎng)48h。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單個(gè)茵落劃線分純，直至純化(茵落單個(gè)大小一致，革蘭氏染色鏡 檢，茵體一致)。結(jié)果分離得到3株不同菌株，分別編號(hào)為菌株1、菌株2、菌株3。再分別轉(zhuǎn)移 到試

37、管斜面上進(jìn)行保存。 分離用培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20g，pH7072 ；保存用斜面培養(yǎng)基：酵母膏1 ，碳酸鈣2 ，葡萄糖1 ，瓊脂2 ，pH 70。 培養(yǎng)條件 將分離出的菌株1、菌株2、菌株3分別接種在上述4種不同的培養(yǎng)基上， 在30。【=恒溫條件下培養(yǎng)48h后觀察并測(cè)定其培養(yǎng)結(jié)果。 測(cè)定方法 菌落總數(shù)采用逐級(jí)稀釋法來(lái)計(jì)數(shù)；pH值用pHS一2C酸度計(jì)測(cè)定；乳酸定性 及含量測(cè)定依據(jù)食品檢驗(yàn)技術(shù) 1I21乳酸菌的分離與篩選的試驗(yàn)程序 自然發(fā)酵酸奶-稀釋-培養(yǎng)-挑起單菌落染色、鏡檢一挑 選革蘭氏陽(yáng)性球菌單菌落一號(hào)培養(yǎng)基一挑選溶鈣圈大的球菌反復(fù)在號(hào)培養(yǎng)基上幾次純化篩選一單菌落優(yōu) 良