探討轉(zhuǎn)基因顯微注射中的基因裝液方法改良

1、探討轉(zhuǎn)基因顯微注射中的基因裝液方法改良<        摘要：目前常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備方法有顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、精子載體法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、人工酵母染色體法及電轉(zhuǎn)移法等16。其中顯微注射仍是最可靠、最廣泛使用的一種方法,因其外源基因整合效率高,對(duì)目的基因無(wú)大小限制,且可以直接獲得純系78，但其過(guò)程煩瑣且要求嚴(yán)格,將基因液裝入微注射針是其成功的關(guān)鍵前提910。當(dāng)前各實(shí)驗(yàn)室普遍使用可編程微量注射儀,該儀器要求將基因液面倒吸至注射針的直管部以獲得穩(wěn)定平衡壓力,但僅用其吸入功能無(wú)法達(dá)到,導(dǎo)致培養(yǎng)液倒吸,基

2、因液被稀釋,從而大大影響了轉(zhuǎn)基因成功率。筆者建立一種簡(jiǎn)單有效的方法以克服這一缺點(diǎn)。 關(guān)鍵詞：  動(dòng)物 遺體修飾 小鼠 轉(zhuǎn)基因 顯微注射 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)1  材料與方法1.1  儀器和材料  PN30拉針儀,MF900煅針儀,IM300可編程微量注射儀（日本Narishige公司）；倒置顯微鏡,顯微操作儀（日本Olympus公司）,G100薄壁毛細(xì)玻璃管（1×90 mm,日本Narishige公司）或BJ40        【內(nèi)容導(dǎo)航】   

3、;      第1頁(yè)：探討轉(zhuǎn)基因顯微注射中的基因裝液方法改良        第2頁(yè)：探討轉(zhuǎn)基因顯微注射中的基因裝液方法改良            第3頁(yè)：探討轉(zhuǎn)基因顯微注射中的基因裝液方法改良             &

4、#160;      原核顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠是一個(gè)嚴(yán)格而煩瑣的過(guò)程,其中將基因液裝入注射針是顯微注射之前必不可少的關(guān)鍵一步。目前完成該步驟的方法有3種：針背虹吸法、針背填充法以及針尖倒吸法。前2種方法均需要特殊的毛細(xì)管,且操作過(guò)程中極容易污染基因液,每次操作基因液的用量大,成本較高。而針尖倒吸法是利用可編程微量注射儀的“FILL”功能將基因液直接從注射針針口倒吸進(jìn)入注射針。該法將基因液從針口倒吸進(jìn)入注射針,既不需要使用昂貴的微載管,且每次只須<1 L的基因液,可以很大程度地節(jié)約基因液的用量；另外,每次吸取少量基因液做成基因液滴的方法

5、可以很大程度地保持基因液的純度,在操作過(guò)程中也不會(huì)對(duì)基因液造成污染。因此,使用倒吸法裝載基因液是最經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的一種方法。3.1  A法的缺陷  筆者使用A法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn),按壓“FILL”按鍵,當(dāng)液面上升到注射針尖細(xì)部一定位置后,再按壓“FILL”按鍵多次,注射針內(nèi)液面沒(méi)有明顯變化,表明A法不能通過(guò)人為控制吸入足夠量的基因液。裝好基因液的注射針下降進(jìn)入培養(yǎng)液后,在顯微鏡下可以觀察到針內(nèi)液面緩慢下降,說(shuō)明顯微注射儀提供的平衡壓力能夠抵消培養(yǎng)液的虹吸效應(yīng),產(chǎn)生使基因液緩慢外流的正壓。而在模擬顯微注射過(guò)程中,連續(xù)按壓數(shù)次顯微注射儀的“INJ”和“CLR”鍵后,在注

6、射儀提供的平衡壓力不變的情況下,針內(nèi)液面開(kāi)始緩慢上升,說(shuō)明原來(lái)的平衡壓力已經(jīng)不能抵消虹吸效應(yīng),使得培養(yǎng)液倒吸進(jìn)入注射針,從而稀釋針內(nèi)的基因液,影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的成功率。注射針的內(nèi)徑越小,其虹吸效應(yīng)就越強(qiáng),當(dāng)基因液液面處于針的尖細(xì)部時(shí),隨著注射過(guò)程進(jìn)行,液面不斷向針尖方向移動(dòng),抵消虹吸效應(yīng)所需的平衡壓力就越高,這就需要在注射過(guò)程中時(shí)時(shí)調(diào)節(jié)“BALN”的壓力,這既增加了顯微注射的困難度,而且實(shí)際上也不大可能實(shí)現(xiàn)。并且,使用該法僅能倒吸入少量基因液,在注射過(guò)程中,需要經(jīng)常按壓“CLR”鍵（10次）來(lái)保證注射針口的通暢,在這個(gè)過(guò)程中會(huì)損失大量的基因液,導(dǎo)致吸入的基因液不足以完成一盤受精卵（2030個(gè)

7、）的注射量,增加了裝載基因液的頻率,亦會(huì)大大影響轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的成功率。3.2  B法的改良  本實(shí)驗(yàn)采用先從注射針背部裝入適量石蠟油的方法（即B法）解決以上問(wèn)題。在基因液裝載的過(guò)程中發(fā)現(xiàn),按壓“FILL”按鍵數(shù)次,石蠟油與基因液的交界面仍然可以上升,表明B法可以通過(guò)增加“FILL”的次數(shù)來(lái)裝入足夠量的基因液,以保證順利完成一盤受精卵的注射,從而節(jié)約注射時(shí)間。而在模擬顯微注射過(guò)程中,連續(xù)按壓數(shù)次顯微注射儀的“INJ”和“CLR”鍵后,在注射儀提供的平衡壓力不變的情況下,針內(nèi)液面仍然緩慢下降,這說(shuō)明只要石蠟油的上液面仍然處于注射針的直管部,即使基因液面在細(xì)管部移動(dòng),仍然不會(huì)影響抵

8、消虹吸效應(yīng)所需的平衡壓力,因此連續(xù)按壓數(shù)次顯微注射儀的“INJ”和“CLR”鍵后,原來(lái)設(shè)定的平衡壓力仍然能夠產(chǎn)生使基因液緩慢外流的正壓,消除了壓力不穩(wěn)定給轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的影響因素。此外,由于石蠟油穩(wěn)定、無(wú)毒、非親水的特性,已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中,相對(duì)于高度提純的基因液來(lái)說(shuō),石蠟油更加經(jīng)濟(jì)且易于獲得。由于石蠟油的非親水性,在基因液后端裝上石蠟油可以防止溶液蒸發(fā)導(dǎo)致基因濃度升高,保持基因注射過(guò)程中基因液的正常濃度。且由于該操作的簡(jiǎn)便、無(wú)菌,在顯微注射過(guò)程中可以重復(fù)裝載基因液,毋需更換新的注射針,減少注射針使用量。用于裝載石蠟油的微載管可以反復(fù)使用,也減少其用量?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 

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