實驗十一細菌質(zhì)粒DNA的提取和純化

1、實驗十一 細菌質(zhì)粒DNA的提取和純化一、實驗目的：通過細菌質(zhì)粒DNA的提取，掌握共價閉合環(huán)狀DNA的提取方法。二、實驗原理：1、細菌中有兩種DNA，即染色體DNA和質(zhì)粒DNA。2、質(zhì)粒DNA的提取方法有三種：堿裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。3、堿裂解法比較劇烈，可破壞堿基配對，使宿主細胞DNA變性，共價閉合環(huán)狀DNA由于空間纏繞，兩條鏈不會徹底分開。當外界條件到達復性條件時，質(zhì)粒DNA的雙鏈又迅速恢復原狀，而較大的線性染色體DNA難以復性。當菌體在NaOH和 SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在

2、上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標記等要求，故在實驗室中常用。三、 實驗材料：含有PMD19質(zhì)粒的大腸桿菌（E. coli.）菌液四、實驗用具和藥品：實驗用具：搖床、離心機、移液器及槍頭、玻璃試管（15mL

3、）及塞子、離心管（1.5mL）。實驗藥品：溶液（高壓滅菌）： 50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0）10 mmol/L EDTA（pH8.0） 溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）： 2 mol/L NaOH10% SDS（十二烷基硫酸鈉）NaOH： SDS：ddH2O=1:1:8溶液：5 mol/L乙酸鉀 60mL冰乙酸 11.5mL水 28.5mL 五、實驗步驟：（一）細菌繁殖 第1天晚上： 吸取含質(zhì)粒的菌液2L，轉(zhuǎn)移入2mL LB（加入相應抗生素），37，過夜振蕩（200r/min）培養(yǎng)。（二）菌體收集 第2天早晨(時間:約2-3h左右： 1、將過夜培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)入1.5m

4、L離心管，5000r/min離心30sec；2、棄上清（三） 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA1、將上述沉淀重懸于100L冰預冷的溶液中，劇烈震蕩（須使沉淀完全分散） (葡萄糖：懸浮細胞；EDTA；抑制DNAase2、加入200L溶液，蓋緊管口，輕柔顛倒離心管510次，該過程應小于5min；（NaOH：溶解細胞膜，釋放DNA；SDS） 3、加入150L冰預冷的溶液，蓋緊管口，溫和地顛倒離心管510次，該過程大于5min；（乙酸鉀 ：和SDS 反應生成PDS（十二烷基硫酸鉀），沉淀蛋白，同時體積較大的染色體DNA也一起沉淀；冰乙酸 ：中和NaOH ）4、10000r/min離心5min；5、上清轉(zhuǎn)移到另一

5、新1.5mL離心管中；6、加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻，室溫放置2min（若沉淀不充分，可加入1/10體積3mol/L的醋酸鈉）；7、10000r/min離心5min；9、 棄上清，干燥沉淀；9、加TE溶解沉淀，保存。六、實驗作業(yè)：思考本實驗的關(guān)鍵步驟是什么？答：本實驗的關(guān)鍵是溶液重懸須充分，溶液混合須溫和。堿裂解法的關(guān)鍵是如何把握SDS-NaOH處理的時間。質(zhì)粒制備過程中，如果質(zhì)粒長時間暴露于NaOH, 質(zhì)粒有可能不可逆變性，使得抽提質(zhì)粒中有部分是變性質(zhì)粒。這些變性質(zhì)粒，不能酶切。所有一般情況下，SDS-KOH處理時間不能超過5分鐘，最好在冰里處理，觀察到液體變得清就可以加入中和液。七、

6、注意事項：1、質(zhì)粒的選取，盡量選擇較小的松弛型質(zhì)粒。2、提取過程應盡量保持低溫。3、溶液II不可冷凍,現(xiàn)用現(xiàn)配，加入溶液2后不要劇烈振蕩，只需輕輕顛倒幾次離心管。復性時間不宜過長，一般是5分鐘，否則會使染色體復性。4、沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇（一般使用等體積），且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。5、應用TE緩沖液溶解沉淀是為了在用苯酚、氯仿抽提時，以減少DNA的損失。6、50%的乙醇可溶解DNA,故應該極其注意70%的乙醇是否蓋子完好,否則稀釋的乙醇有可能將所獲得DNA溶解掉。八、討論與小結(jié)：1.為什么

7、用無水乙醇沉淀DNA？ 用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用95乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95乙醇昂貴）。但是加95的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用9

8、5乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530分鐘即可。 2.在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.10.25mol/L？ 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。本次實驗是能動性、嚴