內(nèi)生放線菌和寄主植物的抑菌活性及其關(guān)系

1、作者：鐘莉 田新莉 周敏 王韜 成秋香 陳振華 范云 覃重軍【摘要】 從68種中草藥植物中分離了560株內(nèi)生放線菌菌株，其中84株(約占15%)對(duì)金葡菌有抑菌活性，36株(約6%)對(duì)白念珠菌有抑菌活性，提示中草藥植物的內(nèi)生放線菌可能是抗菌新藥的一個(gè)來源。檢測(cè)了9種中草藥植物的水或乙醇抽提液對(duì)金葡菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生放線菌菌株的抑菌活性與其寄主植物沒有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】 中草藥植物； 內(nèi)生放線菌； 抑菌活性 ABSTRACT This paper reports that total 84 or 36 out of the tested 560 endophytic actinomy

2、cetes strains from 68 Chinese medicinal herbs, showed inhibition activity against Staphylococcus aureus or Candida albicans, respectively, suggesting a potential source for novel antibiotics. Further investigation by using water or ethanol extracts of the nine herbs against Staphylococcus aureus, in

3、dicated no apparent relationships on inhibition of the pathogen between herbs and their endophytic actinomycetes. KEY WORDS Chinese medicinal herbs; Endophytic actinomycetes; Inhibition activity 目前發(fā)現(xiàn)的放線菌(主要來自土壤)產(chǎn)生的抗生素和生理活性物質(zhì)超過10000種，占已發(fā)現(xiàn)微生物藥物的約2/3。近年來從獨(dú)特生境中分離放線菌并尋找新的抗生素已逐漸受到重視，如從植物組織內(nèi)部中分離其內(nèi)生放線菌和尋找新抗

4、生素。我國(guó)擁有豐富的中草藥植物資源，其中一些中草藥長(zhǎng)期被用來清熱解毒、化膿消腫，提示可能存在抗菌活性物質(zhì)。本文報(bào)道從68種中草藥植物中分離大量的內(nèi)生放線菌，其中約15%菌株具有抗金葡菌的活性，約6%菌株對(duì)白念珠菌有抑菌活性。此外，初步探討了內(nèi)生放線菌與其寄主植物在抗菌活性方面可能的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 1 材料與方法 1.1 中草藥植物和病原菌來源 本試驗(yàn)所用大部分中草藥植物采自上海植物園，丹參和燈盞花采自云南昆明(邱明華研究員提供)，青蒿采自四川酉陽(利民青蒿基地提供)，金葡菌由揚(yáng)州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室金文杰老師提供。 1.2 培養(yǎng)基、試劑和抗生素 試驗(yàn)中分離內(nèi)生放線菌所用的為S培養(yǎng)基、S培養(yǎng)基+重鉻酸鉀

5、+萘啶酮酸、S培養(yǎng)基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+鏈霉素、S培養(yǎng)基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+萬古霉素等4種培養(yǎng)基(重鉻酸鉀的終濃度為85mol/L，萘啶酮酸65mol/L，鏈霉素2g/ml，萬古霉素4g/ml)，純化和進(jìn)一步培養(yǎng)內(nèi)生放線菌采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基。培養(yǎng)金葡菌用LB培養(yǎng)基。 1.3 植物內(nèi)生放線菌的分離 將采摘的新鮮植物用清水洗凈，根、莖、葉各部分分開，于陰涼處風(fēng)干。用70%的乙醇、0.87%的次氯酸鈉和10%的碳酸氫鈉分別處理5、20和10min以達(dá)到表面消毒，接著用無菌水洗滌三次，再用無菌濾紙吸干水分。將植物剪成約1cm的小段，置于上述4種分離培養(yǎng)基表面，于30培養(yǎng)。樣品表面消毒方法參照文獻(xiàn)4

6、，5，分離內(nèi)生放線菌的方法參照文獻(xiàn)，根據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)特征初步鑒定放線菌菌株參照文獻(xiàn)，部分放線菌菌株的鑒定采用16S rDNA序列測(cè)定和比對(duì)。 1.4 內(nèi)生放線菌的抑菌試驗(yàn) 金葡菌或白念珠菌接種于25ml LB液體，37培養(yǎng)過夜，取10ml菌液與250ml LB混合，澆制成平板。植物內(nèi)生放線菌菌株接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基，于30生長(zhǎng)7d，用打孔器在平板上打孔，接種針挑出放線菌瓊脂菌塊，放置在混合有指示菌的平板上，30培養(yǎng)23d后觀察和測(cè)量可能的抑菌圈。 1.5 植物的水或乙醇的提取及提取液的抑菌試驗(yàn) 將采摘的新鮮植物用清水洗凈和風(fēng)干，一份稱取0.8g，用研磨碾碎后加入3.2ml 70%乙醇，隔一段時(shí)間

7、振蕩一次進(jìn)行萃?。涣硪环莘Q取0.1g，進(jìn)行表面消毒(方法同上)，然后剪碎并轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，用研磨碾碎后加入0.4ml無菌水浸泡。將滅菌的圓形濾紙片(4mm)置于混合有指示菌的平板上，加入5l水或醇提取液于濾紙片上，30培養(yǎng)23d后進(jìn)行抑菌圈測(cè)定。 2 結(jié)果 2.1中草藥植物的內(nèi)生放線菌對(duì)金葡菌和白念珠菌的抑菌活性 從上海市植物園、云南昆明和四川酉陽等地采集到68種中草藥植物，表面消毒后在4種固體培養(yǎng)基上共分離，并初步鑒定了560株內(nèi)生放線菌。這些放線菌菌株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上經(jīng)劃線純化培養(yǎng)后打下圓形菌塊，置于混合有金葡菌或白念珠菌的平板上以檢測(cè)可能的抑菌活性。表1結(jié)果顯示，來自35種

8、中草藥植物的84株內(nèi)生放線菌對(duì)金葡菌具有抑菌活性(抑菌圈直徑在4.519mm，詳細(xì)數(shù)據(jù)未列出)，占測(cè)試菌株總數(shù)的約15%。來自33種中草藥植物(包括白毛夏枯草、腹水草、萱草、大蔥、小蔥、大蒜、艾蒿、燈盞花、三七、青蒿、移星草、薄荷、三白草、富貴草、九頭獅子草、絞股藍(lán)、東風(fēng)菜、玄參、白英、茜草、馬兜鈴、博落回、厚果雞血藤、杜仲、山楂、側(cè)柏、苦參、桑樹、雪松、川楝、三尖杉、日本常山云和南旌節(jié)花)的167株內(nèi)生放線菌未檢測(cè)到明顯的抑制金葡菌的活性。 除去分離到較少(如5株)內(nèi)生放線菌菌株的植物外，分離菌株較多的植物如紫金牛、野蕎麥、毛茛和紫菀等的內(nèi)生放線菌菌株具有抑菌活性的比例較高，分別為56%、5

9、0%、50%和41%，提示具有抑制金葡菌活性的植物內(nèi)生放線菌的分布可能有偏好性。 表1結(jié)果顯示，來自22種中草藥植物中的36株放線菌對(duì)于白念珠菌具有抑菌活性(約占測(cè)試菌株總數(shù)的6%)，其中來自貫眾、磨芋、敗醬和陸英等的內(nèi)生放線菌菌株具有抑菌活性的比例較高， 分別為21%、表1 43種中草藥植物中對(duì)金葡菌和白念珠菌有抑菌活性的內(nèi)生放線菌株數(shù) 20%、17%和29%。 2.2 中草藥植物的抽提液對(duì)金葡菌的抑菌活性 為了進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生放線菌菌株與其寄主中草藥植物在有或無抑菌活性方面是否有對(duì)應(yīng)關(guān)系，我們測(cè)定了一些植物提取液的抑菌活性。選取內(nèi)生放線菌菌株具有較高抑菌比例的紫金牛、野蕎麥、毛茛、紫菀和貫眾

10、等5種植物，以及具有較低抑菌比例的陸英、打破碗花花、括樓和澤蘭等4種植物，用水或70%乙醇抽提，檢測(cè)對(duì)金葡菌的抑菌活性。表2結(jié)果表明，雖然紫金牛、毛茛、紫菀和貫眾等4種植物的水或醇提取物具有抑菌活性，但野蕎麥的水或醇提取液中沒有檢測(cè)到抑菌活性；另一方面，雖然括樓的提取液中沒有抑菌活性，但是陸英、打破碗花花和澤蘭的提取液中卻具有抑菌活性。這些結(jié)果顯示，內(nèi)生放線菌菌株對(duì)金葡菌的抑菌活性與其寄主植物沒有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 3 討論 由于植物內(nèi)生菌來自獨(dú)特的生存環(huán)境而成為人們尋找微生物新藥的一個(gè)重要藥源。在植物內(nèi)生放線菌產(chǎn)生抗生素方面，有報(bào)道從杜鵑花6、蛇藤7和衛(wèi)矛科植物8分離到的內(nèi)生放線菌產(chǎn)生了新的抗細(xì)菌或真菌的化合物。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道了水稻內(nèi)生放線菌產(chǎn)生抗真菌的活性9，三葉草中的內(nèi)生放線菌有抗細(xì)菌活性10，西雙版納藥用植物中分離的165株內(nèi)生放線菌中有70株表現(xiàn)抗多種細(xì)菌和真菌活性11。在我們的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)68種中草藥植物的560株內(nèi)生放線菌中表2 9種新鮮中草藥植物的抽提液對(duì)金葡菌的抑菌活性有84株(約15%)對(duì)金葡菌具有抑制活性，有36株放線菌(約6%)對(duì)白念珠菌具有抑菌活性，進(jìn)一步表明中草藥植物內(nèi)生放線菌可能是篩選抗菌新藥的一個(gè)重要資源。 1993年Stierle等12從短葉紅豆杉中發(fā)現(xiàn)一種可以產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，此后還有