動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)痰熱清注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素

1、    動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)痰熱清注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素【摘要】 目的： 應(yīng)用 動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)痰熱清注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素。 方法 ：采用 中國(guó) 藥典2005年版附錄細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)法。結(jié)果: 將痰熱清注射液進(jìn)行180稀釋?zhuān)膳懦蓴_，回收率在50200，無(wú)干擾作用。結(jié)論：應(yīng)用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定痰熱清注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的。 【關(guān)鍵詞】 動(dòng)態(tài)濁度法；痰熱清注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素；干擾實(shí)驗(yàn)痰熱清注射液是由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹制成的中藥復(fù)方注射劑,臨床上用于風(fēng)溫肺熱病屬痰熱阻肺證。本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1中規(guī)定其致熱物質(zhì)檢查為熱原檢查法，該法操作復(fù)雜、時(shí)間

2、長(zhǎng)、費(fèi)用高。本文通過(guò)動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)痰熱清注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，建立痰熱清注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素定量 分析 的方法。1 材料與儀器動(dòng)態(tài)濁度鱟試劑（批號(hào)：0411260，0409228，1.25 mL/支，湛江安度斯生物有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：200610，160 Eu/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；痰熱清注射液（批號(hào)：050915、050926、051026、051125，10 mL/支，新誼醫(yī)藥集團(tuán)·上海凱寶藥業(yè)有限公司）；BET32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天津大學(xué)無(wú)線電廠）；ZH2型漩渦混合器（天津藥典儀器廠）。2 方法與結(jié)果2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定2人體每小

3、時(shí)可以接受的最大內(nèi)毒素劑量為5.0 EU/(kg·h) × 60 kg=300 EU/h（人均體重按60 kg 計(jì)算 ）；按痰熱清注射液使用說(shuō)明書(shū)，20 mL/次，加入5%葡萄糖注射液500 mL，控制滴數(shù)在60滴/min內(nèi)（按每1 mL為20滴計(jì)算），另葡萄糖注射液的內(nèi)毒素限量為0.5 EU/mL；故痰熱清注射液允許帶入的內(nèi)毒素最大限量為300×(500+20)×20/(60×60)-500×0.5÷2030.8 EU/mL。本試驗(yàn)采用30.8 EU/mL作為細(xì)菌內(nèi)毒素限值。2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及可靠性3用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

4、用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溶解稀釋?zhuān)蛊渥罱K內(nèi)毒素濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312 Eu/mL稀釋系列。各取0.2 mL分別加到預(yù)先加有0.1 mL動(dòng)態(tài)濁度鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻。立即插入BET32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，其中每一濃度做3支平行管，并同時(shí)做2支陰性對(duì)照管（NC）。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)（略）結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線為lgT=2.81660.3533lgC，r=0.9928，r>0.980,標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點(diǎn)10.0312 Eu/mL，陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

5、2.3.1 供試品最大稀釋倍數(shù)計(jì)算3按公式MVD=L·C/，L為痰熱清注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值，C為100%，為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低內(nèi)毒素濃度0.0312 Eu/mL，得最大稀釋倍數(shù)（MVD）為987倍。2.3.2 供試品溶液配制及預(yù)干擾實(shí)驗(yàn)4將痰熱清注射液（批號(hào)：050915）用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為120、140、180、1160等比系列稀釋液，作為供試品空白管（Ct），記為A液。同時(shí)另分別取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2 m （m為中點(diǎn)濃度0.125 Eu/mL）和供試品各等比系列的2倍濃度稀釋液，在稀釋用試管中等量混合，得到在此稀釋倍數(shù)下含m內(nèi)毒素的供試品溶液，作為供試品陽(yáng)性管（Cs），

6、記為B液。分別取上述溶液各0.2 mL加入預(yù)先加有0.1 mL動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻。立即插入BET32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，其中每一濃度做2支平行管，并同時(shí)做2支陰性對(duì)照管（NC）。計(jì)算回收率，回收率（）=(Cs-Ct)/m×100，結(jié)果見(jiàn)表2。表2 預(yù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）結(jié)果可見(jiàn)，陰性對(duì)照內(nèi)毒素小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點(diǎn)10.0312 Eu/mL，陰性合格。供試品等比稀釋液中，120稀釋液的回收率為216.7%，說(shuō)明該稀釋液對(duì)鱟試劑有增強(qiáng)作用。140、180、1160稀釋液的回收率均在50200%之間，符合 中國(guó) 藥典規(guī)定。180稀釋液的回收率接近100，

7、最接近真實(shí)值，在日常檢查中，選180稀釋液為宜。2.3.3 干擾實(shí)驗(yàn)另取3批痰熱清注射液，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋為180稀釋液，作為供試品空白管，記為A液。同時(shí)分別取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2 m和供試品140稀釋液，在稀釋用試管中等量混合，得作為供試品陽(yáng)性管，記為B液。分別取兩批鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)。分別取上述溶液各0.2mL加入預(yù)先加有0.1 mL動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻。立即插入BET32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，其中每一濃度做2支平行管，并同時(shí)做2支陰性對(duì)照管（NC）。結(jié)果見(jiàn)表3。表3 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）結(jié)果可見(jiàn)，陰性對(duì)照內(nèi)毒素小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點(diǎn)10.0312 Eu

8、/mL，陰性合格。供試品180稀釋液的回收率均在50200%之間，則該稀釋液對(duì)鱟試劑反應(yīng)無(wú)干擾作用。2.4 定量檢查根據(jù)以上干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)4批痰熱清注射液以180稀釋液進(jìn)行定量檢查。結(jié)果見(jiàn)表4。表4 定量檢查結(jié)果（略）3 討論痰熱清注射液為中藥制劑，其成分較復(fù)雜，故細(xì)菌內(nèi)毒素限值應(yīng)從嚴(yán)考慮。本法結(jié)合臨床實(shí)際用藥及考慮葡萄糖注射液的加和性，確保細(xì)菌內(nèi)毒素限值安全、可靠。在實(shí)驗(yàn)中采取熱原法和動(dòng)態(tài)濁度法在相同實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)測(cè)定，兩種實(shí)驗(yàn) 方法 得到一致的結(jié)果，符合中國(guó)藥典對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)成立的規(guī)定。動(dòng)態(tài)濁度法定量進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)靈敏度高，減少人為誤差，幫助 分析 干擾情況和可以觀察反應(yīng)過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)?！?參考  文獻(xiàn) 】1國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局. 國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)S.（YDZ00912003）.2苑慶華, 芮 菁, 華曉東, 等. 動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)替硝唑注射液中內(nèi)毒素 研究 J. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2003, 38(12): 952953.3中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(二