職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測(cè)方案

1、職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測(cè)方案一、監(jiān)測(cè)目的1二、監(jiān)測(cè)點(diǎn)的設(shè)置1三、監(jiān)測(cè)內(nèi)容和方法2四、職責(zé)分工及組織實(shí)施5五、考核和評(píng)估6六、附表和附件6附表1、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查問卷7附表2、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本登記表9附表3、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)檢測(cè)結(jié)果表10附表4、環(huán)境標(biāo)本采樣登記表11附表5、環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表13附件1、標(biāo)本的采集、處理、保存與運(yùn)輸14附件2、實(shí)驗(yàn)室操作方法簡(jiǎn)介15職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測(cè)方案為做好人感染高致病性禽流感的防控工作，我國(guó)于2004年起在全國(guó)建立了不明原因肺炎監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，在發(fā)生人感染高致病性禽流感病例和/或動(dòng)物禽流感疫情后開展了主動(dòng)應(yīng)急監(jiān)測(cè)

2、。上述監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)我國(guó)人感染高致病性禽流感病例的發(fā)現(xiàn)、調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)以及疫情控制等方面發(fā)揮了重要作用。目前的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，禽類接觸史和訪問活禽市場(chǎng)可能是人感染高致病性禽流感的重要因素。因此，開展對(duì)職業(yè)暴露人群及其環(huán)境的監(jiān)測(cè)，可以進(jìn)一步追蹤感染來源，確定感染高危因素，掌握禽流感病毒致病力和傳播能力的改變，為制定科學(xué)的防控策略以及流感大流行預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)可不斷提高人感染高致病性禽流感監(jiān)測(cè)能力，為流感大流行的應(yīng)對(duì)提供技術(shù)和人員儲(chǔ)備。一、監(jiān)測(cè)目的1、了解職業(yè)暴露人群高致病性禽流感病毒（H5N1）的感染狀況。2、了解高致病性禽流感病毒在環(huán)境中的分布情況。二、監(jiān)測(cè)場(chǎng)所和監(jiān)測(cè)點(diǎn)的設(shè)置根據(jù)各地區(qū)的特點(diǎn)

3、，各設(shè)區(qū)市疾控中心根據(jù)具體情況選擇兩類或以上下述場(chǎng)所作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)。1、城鎮(zhèn)活禽市場(chǎng)：中等以上規(guī)?；钋菔袌?chǎng)作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)。2、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)：每家家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)為一個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)。3、家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)：每個(gè)自然村為一個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)。4、家禽屠宰加工廠：每家家禽屠宰加工廠為一個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)。5、野生禽類棲息地：每個(gè)棲息地為一個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)。各設(shè)區(qū)市選擇監(jiān)測(cè)場(chǎng)所和監(jiān)測(cè)點(diǎn)后，于四月中旬前將整體環(huán)境特點(diǎn)、從業(yè)人員總體情況、禽類養(yǎng)殖、販賣和屠宰情況（規(guī)模、數(shù)量等）、近期禽類免疫情況、近期禽類發(fā)病情況、日常環(huán)境清潔和安全措施等基本信息上報(bào)省CDC確認(rèn)。三、監(jiān)測(cè)內(nèi)容和方法（一）職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)1、監(jiān)測(cè)對(duì)象（1）活禽批發(fā)市場(chǎng)、

4、城鄉(xiāng)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或菜市場(chǎng)中直接與禽類接觸的人員。（2）家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）中直接與禽類接觸的人員。（3）家禽屠宰加工廠中直接與禽類接觸的人員。（4）家禽散養(yǎng)戶的家庭成員。 （5）野生候鳥棲息地中與候鳥或其排泄物有接觸的人員。2、監(jiān)測(cè)時(shí)間每年冬春季開展職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。3、監(jiān)測(cè)內(nèi)容與方法（1）流行病學(xué)調(diào)查收集調(diào)查對(duì)象的基本情況、禽類接觸史等內(nèi)容，填寫“職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查問卷”（見附表1），送省CDC網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室（西安市的問卷送西安市CDC流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室）。（2）標(biāo)本采集、運(yùn)送采集監(jiān)測(cè)對(duì)象的空腹靜脈血5ml，填寫“職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本登記表”（見附表2）。銅川CDC每年

5、采集15份，楊凌區(qū)10份，其他各設(shè)區(qū)市至少采集20份，每年四月底之前完成采集，分離血清，無菌條件下分裝為3份，20或以下凍存（避免反復(fù)凍融）。四月底前將血清及登記表同時(shí)送陜西省CDC。西安市每年至少采集40份血清標(biāo)本，送西安市CDC流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)遵守國(guó)家生物安全的有關(guān)規(guī)定。（3）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)省CDC實(shí)驗(yàn)室在接收標(biāo)本后1個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)工作，填寫“職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)檢測(cè)結(jié)果表”，提交中國(guó)疾控中心病毒病所國(guó)家流感中心。西安市CDC網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室在向國(guó)家流感中心提交結(jié)果的同時(shí)，向省CDC備份一份。（二）環(huán)境標(biāo)本高致病性禽流感病原學(xué)監(jiān)測(cè)1、監(jiān)測(cè)對(duì)象監(jiān)測(cè)點(diǎn)的水、籠具表面等環(huán)境標(biāo)本。

6、 2、監(jiān)測(cè)時(shí)間 全年監(jiān)測(cè)，每月采集1次標(biāo)本，避免在監(jiān)測(cè)點(diǎn)消毒后2日內(nèi)開展。 3、監(jiān)測(cè)方法 （1）標(biāo)本采集 各設(shè)區(qū)市疾控中心至少每月采集標(biāo)本1次，每月采集各類標(biāo)本至少8份，楊凌區(qū)每年至少采集20份，全年采集應(yīng)分布在不同場(chǎng)所，同時(shí)填寫“環(huán)境標(biāo)本采樣登記表”（附表4）。標(biāo)本采集種類及方法（見附件1）。（2）標(biāo)本運(yùn)輸、處理標(biāo)本采集后應(yīng)在4條件下48小時(shí)內(nèi)運(yùn)送至省CDC網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室（西安市的標(biāo)本送西安市CDC網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室）。實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后應(yīng)立即進(jìn)行標(biāo)本處理（見附件1），并將標(biāo)本分為3份，1份用于核酸檢測(cè)，1份留樣保存，1份備送國(guó)家流感中心進(jìn)行復(fù)核。留樣標(biāo)本要求在70或以下凍存。每月采集后于五日內(nèi)送相關(guān)

7、實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)遵守國(guó)家生物安全的有關(guān)規(guī)定。（3）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)省CDC和西安市流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后1周內(nèi)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行流感病毒A和B型核酸檢測(cè)。A型流感病毒核酸陽性時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行H5N1亞型檢測(cè)，填寫“環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表”（附表5）。網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室每季度向國(guó)家流感中心提交“環(huán)境標(biāo)本采樣登記表”（附表4）和“環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表”（附表5），西安市CDC網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室在向國(guó)家流感中心提交結(jié)果時(shí)，同時(shí)向省CDC備份一份。對(duì)于所有A型流感病毒核酸陽性的標(biāo)本，在完成檢測(cè)后24小時(shí)內(nèi)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告國(guó)家流感中心，并及時(shí)將標(biāo)本送國(guó)家流感中心進(jìn)行復(fù)核。國(guó)家流感中心對(duì)全部陽性標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核，并在標(biāo)本收到后48

8、小時(shí)將向省CDC及各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行反饋。四、附表和附件附表1、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查問卷附表2、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本登記表附表3、職業(yè)暴露人群血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表附表4、環(huán)境標(biāo)本采樣登記表附表5、環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表附件1、標(biāo)本的采集、處理、保存與運(yùn)輸附件2、實(shí)驗(yàn)室操作方法簡(jiǎn)介附表1 職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查問卷省市縣編碼 血清標(biāo)本編號(hào) 一、一般情況1、姓名： （電話： ） 2、性別： 男性 女性3、年齡： 周歲 4、現(xiàn)住址： 5、職業(yè)： 幼托兒童 散居兒童 學(xué)生（大中小學(xué)） 教師 保育員及保姆 餐飲食品業(yè) 商業(yè)服務(wù) 醫(yī)務(wù)人員 工人 民工 農(nóng)民 牧民 漁（船） 民 干部職員

9、離退人員 家務(wù)及待業(yè) 其他 不詳二、暴露情況（可多選）6、職業(yè)暴露人群種類：散養(yǎng)戶 規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)從業(yè)人員 活禽批發(fā)市場(chǎng)人員 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或菜市場(chǎng)活禽交易人員 家禽屠宰加工廠人員 野生候鳥棲息地接觸鳥類人員 其他 7、暴露方式： 喂養(yǎng) 清掃禽舍 加工（宰殺、拔毛、洗切、腌制、烹飪） 食用 捕殺 運(yùn)輸 捕捉 銷售 其他 8、如為養(yǎng)殖人員，禽類養(yǎng)殖方式： 雞 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng) 鴨 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng) 鵝 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng) 鴿子 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng) 其他 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng)9、近一個(gè)月來，接觸禽種類： 雞 鴨 鵝 鴿子 野禽 其他 10、所接觸的禽類是否接種過禽流感疫苗？ 是 否

10、不詳11、近一個(gè)月以來，是否接觸過病死禽？ 是 否 不詳 （1）病死禽種類： 雞 羽 鴨 羽 鵝 羽 鴿子 羽 其他 羽 （2）接觸方式為： （可多選） 喂養(yǎng) 清掃禽舍 加工（宰殺、拔毛、洗切、腌制、烹飪） 食用 捕殺 運(yùn)輸 捕捉 其他 （3）接觸病死禽時(shí)是否有防護(hù)措施？ 是 否 不詳 如果有，采取的措施有： （可多選）戴口罩（N95口罩、過濾口罩、棉紗口罩、一次性外科口罩） 戴面罩 穿防護(hù)服（規(guī)范、不規(guī)范）防護(hù)眼鏡 手套 帽子白大衣 其它 （4）接觸病死禽的持續(xù)時(shí)間： 天（ 月 日到 月 日）累計(jì)暴露： 小時(shí)12、近1個(gè)月是否出現(xiàn)過發(fā)熱？ 是 否 不詳 （1）發(fā)熱起始時(shí)間 月 日，共持續(xù) 天

11、，最高體溫 （2）發(fā)熱時(shí)是否伴有其它不適癥狀？ 是 否 不詳 出現(xiàn)癥狀起始時(shí)間 月 日，共持續(xù) 天，主要癥狀有：頭痛 咽痛 鼻塞 肌肉酸痛 腹痛 腹瀉 其它 13、近1年是否接種過流感疫苗？ 是 否 不詳調(diào)查人員單位： 調(diào)查人員： 調(diào)查日期： 審核人員： 審核日期： 附表2 職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本登記表采集地點(diǎn) ： 縣（市、區(qū)） 鄉(xiāng)（鎮(zhèn)） 標(biāo)本編號(hào)姓名年齡性別現(xiàn)住址采樣日期標(biāo)本量備注注：1.采集地點(diǎn)：填寫標(biāo)本采集地的禽類場(chǎng)所名稱2.標(biāo)本編號(hào)原則：（1）血清標(biāo)本代號(hào) ：B （2）09年（3）網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室流水號(hào)(4) 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本編號(hào) 從001開始例如陜西省疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本 B0976001 ，西安

12、市疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本B0977001采集人： 采集單位 ： 送檢日期： 附表3 職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)檢測(cè)結(jié)果表檢測(cè)單位 ： 1.檢測(cè)方法：馬血球HI（ ）、SRH（ ）2.使用抗原： 參考血清名稱： 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)本編號(hào)檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本狀態(tài)備注HI滴度SRH直徑注：1、標(biāo)本狀態(tài)：溶血，乳糜血，黃疸，血清少 檢測(cè)者： 檢測(cè)日期： 復(fù)核者： 附表4 環(huán)境標(biāo)本采樣登記表采集地點(diǎn) ： 縣（市、區(qū)） 鄉(xiāng)（鎮(zhèn)） 標(biāo)本編號(hào)采集日期采集地點(diǎn)標(biāo)本種類備注注：1. 標(biāo)本編號(hào)原則：（1）環(huán)境標(biāo)本代號(hào)： C （2）09年（3）網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室流水號(hào)(4) 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本編號(hào) 從001開始 例如陜西省疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本 C09

13、76001 ，西安市疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本C0977001采集人： 采樣單位 ： 送檢日期： 附表5 環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表檢測(cè)單位 ： 采用的檢測(cè)方法：One-step PCR： Real time PCR： 1. One-step 試劑盒2. Real-time 試劑盒：3. 引物來源：4檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本編號(hào)采樣日期檢測(cè)結(jié)果備注A型B型H5N1其他陰性操作者： 檢測(cè)日期： 復(fù)核者： 附件1：標(biāo)本的采集、處理、保存與運(yùn)輸（一） 標(biāo)本采集與處理1. 血清標(biāo)本取真空負(fù)壓采血管，做好標(biāo)記，采集監(jiān)測(cè)對(duì)象空腹靜脈血5mL。然后置于室溫?cái)?shù)小時(shí)待血完全凝固。1500rpm2000rpm離心10min，收集血清

14、分裝于3支帶外螺旋蓋的凍存管中，做好標(biāo)記。2. 環(huán)境標(biāo)本環(huán)境標(biāo)本采樣液可使用Hank's或Eagle's等培養(yǎng)液加入以下抗菌素和0.5%BSA： 氨芐青霉素 (2 x 106 IU/L)、 鏈霉素 (200 mg/L) 、多粘菌素 B (2 x 106 IU/L) 、 慶大霉素 (250 mg/L) 、 制霉菌素 (0.5 x 106 IU/L) 、 鹽酸氧氟沙星 (60 mg/L)、磺胺甲基異惡唑 (0.2 g/L)（1）水標(biāo)本在禽類活動(dòng)或籠具旁的水溝或水池的不同部位共收集水標(biāo)本15-20ml置于50ml外螺旋蓋的管內(nèi)。水樣標(biāo)本到實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)在采樣管中加入上述抗生素和0.5%B

15、SA，再進(jìn)行分裝。呼吸道和環(huán)境標(biāo)本要在無菌條件下反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎粘液和固體，置4待其自然沉淀510min，取上液分裝。分裝好留1份進(jìn)行核酸檢測(cè)。（2）籠具表面標(biāo)本用沾有采樣液的帶有聚丙烯纖維頭的拭子擦拭籠具表面3-5個(gè)不同部位，然后將擦拭過的拭子放入含5ml采樣液的采樣管中，尾部棄去。（二）標(biāo)本保存和運(yùn)輸1血清標(biāo)本保存可置4存放3天，存放超過3天需置-20或以下保存。2. 標(biāo)本運(yùn)輸 標(biāo)本放入專用運(yùn)輸箱內(nèi)（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力的材料。同時(shí)寄送標(biāo)本登記表。異地運(yùn)輸可以采用郵寄或快遞的方法，運(yùn)輸要求符合國(guó)家生物安全有關(guān)規(guī)定。病原學(xué)標(biāo)本按B類感

16、染性物質(zhì)進(jìn)行運(yùn)輸，航空采用UN3373包裝。 （三）標(biāo)本接收單位和聯(lián)系方式陜西省疾病預(yù)防控制中心：F電話件2：實(shí)驗(yàn)室操作方法簡(jiǎn)介一、馬紅細(xì)胞血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)禽流感抗體（一）生物安全要求禽流感H5N1亞型檢測(cè)抗原的滅活需要在BSL-3 級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。其余操作均在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。（二）材料1抗原：滅活的H5N1流感病毒。2血清：（1）陽性對(duì)照血清；陰性對(duì)照血清（2）待檢血清3其他主要試劑：（1）馬紅細(xì)胞（1:1的比例保存于阿氏液中，建議采血后72小時(shí)內(nèi)使用）（2）磷酸鹽緩沖液（PH 7.2 PBS）：0.01M；（3）牛血清白蛋白（BSA）；（4）霍亂濾液（RD

17、E）4其他：（1）“V” 型96孔微量板（2）37及56水浴鍋（3）臺(tái)式離心機(jī)（4）多道可調(diào)加樣器（5）離心管（三）質(zhì)量控制1、對(duì)照血清每塊96孔板上均需要設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，同批次的陽性對(duì)照結(jié)果 滴度應(yīng)保持2倍以內(nèi)。2、紅細(xì)胞對(duì)照實(shí)驗(yàn)可根據(jù)紅細(xì)胞對(duì)照來判斷反應(yīng)時(shí)間，盡可能在每塊96孔板上設(shè)計(jì)一 孔紅細(xì)胞對(duì)照（PBS+1%紅細(xì)胞懸液）。3、病毒回滴 一個(gè)紅細(xì)胞凝集單位指能引起等量標(biāo)準(zhǔn)化的紅細(xì)胞凝集時(shí)病毒的量。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)時(shí)一般用4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位（指25L體積中含有4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位）的病毒量。（四）實(shí)驗(yàn)步驟1血清處理（1）用單道加樣器吸出1體積血清置于無菌Eppendorf管內(nèi)

18、，換滴頭加入4體積RDE，吹打混勻。 （2）置37水浴1618h。（3）從37水浴取出后置56水浴30min滅活。（4）馬紅細(xì)胞吸附：瞬時(shí)離心，待冷卻后加入清洗后的濃紅細(xì)胞達(dá)20%（每100µLRDE處理過的血清加入20µL清洗后的濃紅細(xì)胞）。混勻后室溫吸附1 h。（5）2000rpm離心5min。（6）小心吸取上清液至干凈離心管中備用。如不需立即檢測(cè)可放4保存。2馬紅細(xì)胞的采集及1%馬紅細(xì)胞懸液的配備（1）在注射器里放入一定體積的阿氏液，從頸靜脈處采集馬血后放入容器中，輕柔混勻，如阿氏液不足則需補(bǔ)足（阿氏液和紅細(xì)胞的比例為1:1）。（2）采集的馬紅細(xì)胞應(yīng)放入冰箱4保存，越

19、新鮮越好，建議在采集后72小時(shí)內(nèi)使用。（3）在配置1%馬紅細(xì)胞懸液前需清洗紅細(xì)胞液。首先加入5mL紅細(xì)胞（沉積在容器底部的紅細(xì)胞）至50mL離心管。加入45mL PBS-0.5% BSA使總體積達(dá)到50mL，輕柔混勻。（4）2000rpm(600×g) 離心5 min。（5）吸掉上清液后，連續(xù)重復(fù)步驟（3）-（4）兩次。（6）為了精準(zhǔn)馬血球的濃度，取濃縮后的馬血球1ml于1.5ml離心管中，3600g（8000rpm）離心10min，吸取壓縮后血球的上清并統(tǒng)計(jì)出吸取上清的體積，計(jì)算實(shí)際的血球百分比（一般達(dá)到未壓縮前體積的60-75%）。將完全壓縮后的馬血球棄去。（7）計(jì)算最終的血球量

20、使?jié)舛冗_(dá)到完全壓縮后的1%，取所需洗好馬血球的體積加入PBS-0.5% BSA中，每次用前輕輕混勻后使用。3. 制備用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)的4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的抗原（1）將微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1H1稱為第一列；平行方向稱行，如A1A12稱為A行。標(biāo)記好標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原及加樣順序。1）吸取50L PBS加入微量板的第二列至最后一列，于第一列加入100L標(biāo)準(zhǔn)診斷病毒。2）從第一列取50L病毒液，依次從第二列至第八列做2倍系列稀釋。最后一列每孔棄去50L稀釋后的病毒液。3）每孔加入50L 1%的紅細(xì)胞懸液，輕彈微量板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合。4）室溫孵育4560min，觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象

21、并記錄結(jié)果。5）結(jié)果判定：紅細(xì)胞凝集滴度的判定以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點(diǎn)，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的紅細(xì)胞凝集滴度。紅細(xì)胞完全凝集以“+”記錄；無凝集或部分凝集“-”記錄。（2）制備4個(gè)紅細(xì)胞凝集抗原時(shí)：首先計(jì)算出紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)所需的病毒抗原的總量。如每份血清作8孔稀釋，每孔用抗原25L抗原，那么測(cè)定一份血清需0.2mL抗原。根據(jù)參比血清的份數(shù)計(jì)算出實(shí)驗(yàn)所需病毒抗原量，然后配制抗原。（3）計(jì)算出病毒稀釋度。用病毒紅細(xì)胞凝集滴度（HA滴度）除以8，得到的商即為4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的稀釋度。如，某病毒的HA滴度為64，除以8等于8。按1:8（1mL病毒液加7mL PBS）稀釋該病毒即可得到4

22、個(gè)凝集單位/25L的抗原病毒量。（4）為了保證紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中抗原用量一致并且準(zhǔn)確無誤，新配制的4個(gè)凝集單位抗原須復(fù)核滴定：取50L稀釋好的抗原，用等量PBS做倍比稀釋（同病毒滴定）后加入50L紅細(xì)胞懸液，至室溫孵育4560min后觀察凝集結(jié)果。如只有前4孔出現(xiàn)凝集，表明每50L病毒含有8個(gè)凝集單位（即25L中含有4個(gè)紅細(xì)胞凝集），該病毒稀釋準(zhǔn)確，可以用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。如第5孔也出現(xiàn)凝集，說明每50L病毒含有16個(gè)凝集單位，該抗原必須等量稀釋。如只有前3孔凝集，表明每50L病毒僅含有4個(gè)凝集單位，病毒量需要加倍。此外，4個(gè)凝集單位抗原必須每次用前新配制。4紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）檢

23、測(cè)血清抗體將微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1H1稱為第一列；平行方向稱行，如A1A12稱為A行。標(biāo)記好待檢病毒的實(shí)驗(yàn)室編號(hào)及加樣順序。（1）每孔加入25L PBS。（2）A1加入25L標(biāo)準(zhǔn)診斷血清作為陽性對(duì)照；A2加入25L H5N1陰性血清作為陰性對(duì)照。（3）自A3孔開始分別加入25L待檢血清；（4）用多道加樣器吸取25L血清（A1-A12），由A行至H行做2倍系列稀釋血清，至H行后棄去25L。系列稀釋時(shí)需注意每一次稀釋都應(yīng)混合均勻。（5）加入25L含4個(gè)凝集單位的抗原。（6）混勻后室溫孵育30min。（7）每孔加入50L 1%馬紅細(xì)胞懸液，輕彈微量板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合。（8）室

24、溫孵育45-60min，觀察紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)結(jié)果。（9）結(jié)果判定當(dāng)特定的抗體與相應(yīng)的紅細(xì)胞凝集抗原結(jié)合后，可以抑制病毒引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)是指抑制紅細(xì)胞凝集出現(xiàn)時(shí)血清的最高稀釋度的倒數(shù)。如1:80稀釋的血清孔不出現(xiàn)凝劑（紅細(xì)胞凝集完全抑制），1:160稀釋的血清孔出現(xiàn)凝集（無紅細(xì)胞凝集抑制），該血清對(duì)測(cè)定病毒的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)為80。人血清對(duì)H5N1抗原的抑制效價(jià)1:160可判定為陽性（參考WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)），但還需要用另一種血清學(xué)方法驗(yàn)證。二、流感/禽流感單放射免疫擴(kuò)散溶血技術(shù)抗體檢測(cè)（一）生物安全要求抗原的制備和血清滅活根據(jù)所從事病毒的種類在相應(yīng)的生物安全級(jí)別實(shí)驗(yàn)室進(jìn)

25、行，SRH檢測(cè)在生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。（二）材料1Alsevers 液2pH 7.2 PBS緩沖液310%疊氮鈉（sodium azide， NaN3）溶液 45×10-4mol/L KIO4（過碘酸鉀）溶液11.5 mg KIO4加入pH7.2 PBS 溶液至100mL，完全溶解后置4保存。51%瓊脂糖61%雞紅細(xì)胞懸液7濃雞紅細(xì)胞（洗滌后去掉上清的雞紅細(xì)胞）8補(bǔ)體的制備至少6只健康成年豚鼠，采血前一天下午禁食，第二天上午從心臟采血，每只可采510mL，每只采完后速至冰上，多只豚鼠血清混勻后使用，當(dāng)天分離血清，分裝，置-70冰箱中保存。由于補(bǔ)體耐熱性差，因此，操

26、作時(shí)盡量在4條件下進(jìn)行。9抗原一般采用接種雞胚尿囊腔后收獲的流感/禽流感病毒液，甲醛滅活的病毒需在-70中保存，并且注意避免反復(fù)凍融。10參比血清抗H5N1病毒兔血清及普通流感病毒參比兔血清。11測(cè)定血清血清檢測(cè)前56 30min滅活去除血清中不耐熱的非特異性抑制素和補(bǔ)體；血清從56水浴箱中取出，置室溫冷卻，每管加終濃度為20%的濃雞紅細(xì)胞，混勻，置室溫1h或4過夜，1500rpm離心10min，棄沉淀物，留上清。紅細(xì)胞吸附的目的是去除人血清中可能含有對(duì)雞紅細(xì)胞的嗜異性抗體（Forssmans antibody）。12免疫擴(kuò)散板13打孔器，孔徑為2mm和3mm的打孔器。14小燒杯，帶蓋的可裝擴(kuò)

27、散板的塑料盒。15測(cè)量放大鏡（帶有每個(gè)刻度0.1mm的刻度尺）或一般透明并帶刻度的尺子。根據(jù)測(cè)量的溶血圈直徑，可按下列公式計(jì)算出溶血圈面積（S）：S1=R12 S2=R22 S=S1-S2 如用3mm孔徑，測(cè)量的溶血圈直徑為8mm，代入上述公式就可算出溶血圈面積：S1=R12 = ×42=3.1416×16=50.27（mm2）S2=R22=×1.52=3.1416×2.25= 7.07（mm2）S=S1-S2=50.27-7.07=43.20 （mm2）（三）實(shí)驗(yàn)步驟1、病毒抗原紅細(xì)胞凝集滴度的測(cè)定及1000個(gè)紅細(xì)胞凝集單位計(jì)算（1）病毒抗原紅細(xì)胞凝集

28、滴度的測(cè)定采用雞血球，按常規(guī)流感病毒96孔微孔板進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。（2）1000個(gè)紅細(xì)胞凝集單位計(jì)算根據(jù)紅細(xì)胞凝集滴度算出1000個(gè)紅細(xì)胞凝集單位所需測(cè)定病毒的量。如病毒滴定時(shí)紅細(xì)胞凝集滴度為64，則按下列公式計(jì)算：0.05:64=x:1000, x =（0.05×1000）/64=50/64=0.78（mL）也就是說，每0.1mL濃的雞紅細(xì)胞中需要加入0.78mL測(cè)定的病毒溶液。按這個(gè)比例算出實(shí)驗(yàn)所需的病毒量。2溶解1%瓊脂糖并恒溫于60水浴箱中。使用PH7.2 的PBS同時(shí)加入1NaN3以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。煮沸或者用微波爐使1%瓊脂糖完全溶解，速置60水浴箱中，分裝于小燒杯中，2.9

29、mL/杯，置60水浴箱中。根據(jù)工作量計(jì)算出所需燒杯的數(shù)量。3紅細(xì)胞處理按每塊擴(kuò)散板需50µl 濃的雞紅細(xì)胞，計(jì)算出工作中所需的濃紅細(xì)胞容量，將所需的濃雞紅細(xì)胞放入帶尖底的15mL離心管中，加入等容量的5×10-4 mol/L KIO4，混勻，置室溫15min。 KIO4處理的目的是使病毒吸附到紅細(xì)胞表面后不會(huì)游離下來。4加病毒抗原按每0.1mL 濃雞紅細(xì)胞需1000個(gè)紅細(xì)胞凝集單位病毒抗原的比例，加入KIO4處理過的紅細(xì)胞，混之，置室溫10min，1500rpm離心3min，棄上清，用至少5倍量于沉淀物的pH7.2 PBS沖洗，1500rpm離心10min，棄上清，加入與紅

30、細(xì)胞等量的pH7.2 的PBS。5把所需的擴(kuò)散板平排好，并標(biāo)明標(biāo)記。6溶血板制備用吸管將步驟中紅細(xì)胞輕輕吹勻，而后吸出100µL放入恒溫在60水浴箱中含2.9mL瓊脂糖的燒杯，置水浴中搖勻，而后迅速倒入擴(kuò)散板中，并迅速用燒杯鋪平之。待第一塊板鋪完后，按同法鋪第二塊板，直至全鋪完。溶血板凝固后應(yīng)為紅細(xì)胞均勻分布的透明凝膠板，若出現(xiàn)芝麻樣顆粒、濃淡不均的血絲等，均應(yīng)重新進(jìn)行鋪板。7打孔待瓊脂糖完全凝固（一般置室溫1520min）后打孔，診斷用打3mm直徑孔，血清流行病學(xué)調(diào)查打2mm直徑孔。打完后用針頭將孔中瓊脂挑出，然后蓋上板蓋。8加樣孔徑3mm的一般10µL/孔，孔徑2mm的

31、為45µL/孔，每批實(shí)驗(yàn)必須要有陽性和陰性血清對(duì)照；配對(duì)血清應(yīng)在同一板上進(jìn)行，以便減少板間的誤差。9擴(kuò)散當(dāng)每塊板加完樣本，馬上蓋上板蓋。待全部板加完樣本并蓋上板蓋，平放在帶有濕度的盒子中，置4冰箱擴(kuò)散1618h。10加補(bǔ)體補(bǔ)體從-70冰箱取出，用自來水龍頭沖之，讓其速溶。溶后速置冰上，用冷的pH 7.2 PBS進(jìn)行1:3或1:4稀釋，即1mL補(bǔ)體稀釋成3mL或4mL。將擴(kuò)散板從冰箱取出，平放實(shí)驗(yàn)桌上，每板平鋪稀釋好的補(bǔ)體1mL，平放帶有濕度的盒中，無需板蓋，平放3537 孵箱4h。正常紅細(xì)胞對(duì)照板，除病毒用pH7.2 PBS替代外，其余操作步驟完全與實(shí)驗(yàn)板相同。11結(jié)果觀察和判斷4

32、h以后，從孵箱中取出，倒掉補(bǔ)體，進(jìn)行結(jié)果觀察。（1）陽性對(duì)照血清應(yīng)出現(xiàn)清晰，而不是模糊或不透明的溶血圈，并溶血圈面積比預(yù)實(shí)驗(yàn)的不能相差1.5倍或以上；陰性對(duì)照血清不應(yīng)出現(xiàn)任何溶血圈。（2）正常紅細(xì)胞對(duì)照板不應(yīng)出現(xiàn)任何溶血圈。（3）恢復(fù)期血清溶血圈面積應(yīng)為急性期的2倍表示有意義的差異；兩者相差1.5倍為實(shí)驗(yàn)誤差；兩者相差1.5倍或以上但不到2倍，需重復(fù)測(cè)定，如仍相差1.5倍或以上但不到2倍，可判為有意義差異。如重復(fù)測(cè)定相差為1.5倍，表示為實(shí)驗(yàn)誤差。不配對(duì)血清測(cè)定時(shí)，2mm孔徑的，溶血圈直徑需4mm（溶血圈面積9.42mm2）；3mm孔徑的，溶血圈直徑需5mm（溶血圈面積12.57mm2）可認(rèn)為

33、是陽性血清。12注意事項(xiàng)（1）抗原量一定要掌握準(zhǔn)確，量過大一方面使測(cè)定敏感性下降，另一方面由于過量的病毒顆粒吸附在紅細(xì)胞表面，紅細(xì)胞不易吹散開，鋪板時(shí)易出現(xiàn)芝麻樣顆粒，過少的紅細(xì)胞溶解不清晰或不溶解。（2）血清盡量避免反復(fù)凍融，因反復(fù)凍融會(huì)產(chǎn)生抗補(bǔ)體影響溶血圈的清晰度。（3）雙份配對(duì)的血清應(yīng)在同一塊板上進(jìn)行測(cè)定，以便避免板間的誤差。（4）陽性對(duì)照血清，有時(shí)由于滴度過高，出現(xiàn)很大的溶血圈，把鄰近的孔覆蓋，因此，最好靠近它的孔不加樣本或?qū)㈥栃匝暹M(jìn)行適當(dāng)稀釋，如1:5稀釋，而后使用之。（5）對(duì)患者進(jìn)行血清學(xué)診斷時(shí)，建議用3mm孔徑的孔，因用2mm孔徑有時(shí)會(huì)出現(xiàn)重疊溶血圈影響結(jié)果準(zhǔn)確的判斷。進(jìn)行血清

34、流行病學(xué)調(diào)查時(shí)建議用2mm孔徑。（6）測(cè)量溶血圈直徑時(shí)，應(yīng)測(cè)量最清晰的，因標(biāo)準(zhǔn)的溶血圈常為靠近孔邊緣出現(xiàn)清晰透亮的溶血圈，它的外圍出現(xiàn)不十分清晰的溶血圈，此溶血圈外圍又有個(gè)清晰的溶血圈，這是要測(cè)量的直徑。測(cè)量時(shí)，尺子要挨在擴(kuò)散板上。（7）正常紅細(xì)胞對(duì)照板所出現(xiàn)的溶血圈面積與實(shí)驗(yàn)板幾乎一樣大小，表明嗜異性抗體未完全去除干凈，應(yīng)再用雞紅細(xì)胞進(jìn)行再吸附來去除之；如對(duì)照板所出現(xiàn)的溶血圈面積比實(shí)驗(yàn)板小2倍或以上，一般不影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。（8）瓊脂糖最好用高純度，低熔點(diǎn)，在有效期內(nèi)，新鮮配制的，配好后保存期不超過一個(gè)月，因保存期過長(zhǎng)，鋪板時(shí)易造成瓊脂板出現(xiàn)裂縫。（9）一定要加1NaN3以防止細(xì)菌生長(zhǎng)，

35、因細(xì)菌會(huì)造成非特異性溶血。（10）溫度一定要控制好，因補(bǔ)體不耐熱，操作補(bǔ)體時(shí)間盡量要縮短，并在4下操作；補(bǔ)體一定為6只豚鼠的混合血清。（11）禽類血清不結(jié)合豚鼠補(bǔ)體，不應(yīng)用雞的抗血清作為陽性對(duì)照血清。（12）如缺乏時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察和測(cè)量，可將實(shí)驗(yàn)板置4冰箱，至少一星期進(jìn)行測(cè)量不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；溶血板制備完后，平放帶濕度的盒中，置4冰箱，最長(zhǎng)只能存兩星期。三、A型流感病毒RT-PCR檢測(cè)（一）生物安全要求分裝標(biāo)本、裂解病毒需在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)操作。核酸檢測(cè)區(qū)域要分出試劑配制、核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)的不同分區(qū)。（二）主要材料1提RNA Kit：QIAGEN RNeasy Mini

36、Kit （catalog #74104）2巰基乙醇（SIGMA -Mercaptoethanol Lot 062K0115）370乙醇4RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）5Promega RNasin Ribonuclease Inhibitor （catalog #N2111）6檢測(cè)引物：Forword and Reverse Primers（均為10M），序列如下：類型序列甲型通用FluA-M-F30FluA-M-R2645- TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG -35- ACA AAG CGT C

37、TA CGC TGC AG -3（三）實(shí)驗(yàn)步驟1RNA提?。?）根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500L（在體系配制區(qū)操作）。（2）加標(biāo)本100ul到裂解液中。（3）每管分別加入5L -巰基乙醇，混勻后依次加入600L 70%的乙醇，充分混勻。（4）從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標(biāo)記。取步驟2中的混合液600L加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。（5）濾柱仍放回收集管上，將步驟2剩余的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。（6）于濾柱中加入700L Wash Buffer RW

38、1液，12000rpm，離心15s。（7）從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干凈的2mL收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加入500L Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。（8）棄收集管中的離心液，再于濾柱中加入500L Wash Buffer RPE液，1300014000rpm，離心2min。（9）將濾柱移到一個(gè)干凈的1.5mL eppendorf管上，向?yàn)V柱中加入3050L的Rnase-free Water，室溫靜置13min。（10）12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實(shí)驗(yàn)或-20以下保存。

39、注意：Buffer RPE使用之前加無水乙醇。2反應(yīng)體系配制 （1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：檢測(cè)標(biāo)本RNA時(shí)，陰性對(duì)照用無菌水，陽性對(duì)照用已知病毒RNA。（2）PCR反應(yīng)體系配制（在體系配制區(qū)配反應(yīng)液）組 分體 積（L）5×RT-PCR Buffer5×n10mM dNTP Mixture1×nRT-PCR Enzyme Mix1×nRNase Inhibitor0.1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×nRNase Free Water11.9×n Total20×n2）將上述反應(yīng)液混勻，分裝到0.2mL PCR小

40、管中，每管20L，分別做好標(biāo)記。3）加RNA模板（在核酸提取區(qū)）將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對(duì)照管（5L無菌水），然后分別加標(biāo)本RNA（每管5L），最后加入陽性對(duì)照RNA（每管5L）。（3）RT-PCR將上述加好模板的反應(yīng)管混勻，短暫離心后放入PCR儀進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下：1）60作用1min， 2）42作用10min， 3）50作用30min4）95作用15min， 5）94變性30s， 6）50退火30s，7）72延伸1min，回到第5步，34個(gè)循環(huán)， 8）72作用10min，9）4 保存（4）RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)：1）將制備好的1.5瓊脂糖凝膠入電泳槽

41、（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。2）PCR產(chǎn)物各取10L，加入2L上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻后加入電泳膠孔內(nèi)先加Marker（DL2000）5L，然后依次加標(biāo)本PCR產(chǎn)物，再加陰性對(duì)照，最后加陽性對(duì)照產(chǎn)物）。3）觀察結(jié)果并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。（四）結(jié)果判斷：在系統(tǒng)成立，即陰陽性參考均正常的條件下，判斷結(jié)果，陽性各條帶為：甲型（210bp）出現(xiàn)特異性條帶，判為陽性結(jié)果。未出現(xiàn)條帶，或不在上述位置出現(xiàn)非特異性條帶，均判為陰性結(jié)果。四、A型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time）RT-PCR技術(shù)，是指在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)RT-PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量或定性分析的方法。如下是幾個(gè)在結(jié)果判斷中涉及到的幾個(gè)概念：圖1：Real-Time RT-PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線1閾值（threshold）：PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是615個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。2基線（baseline）：指PCR反應(yīng)指數(shù)擴(kuò)增前平均本底熒光信號(hào)值，通常取615個(gè)循環(huán)的平均熒光信號(hào)值。3Ct值：C代表Cycle，t代表t