抗菌效果鑒定試驗(yàn)

1、消毒技術(shù)規(guī)范95頁(yè)到109頁(yè)2.7 抗（抑）菌效果鑒定試驗(yàn)2.7.1 目 的測(cè)定抗（抑）菌產(chǎn)品對(duì)細(xì)菌和真菌的抗（抑）菌作用。常使用的方法有抑菌環(huán)試驗(yàn)、最小抑制濃度測(cè)定試驗(yàn)、滯留抑菌效果測(cè)定試驗(yàn)、洗衣粉抗菌效果測(cè)定試驗(yàn)、振蕩燒瓶試驗(yàn)、浸漬試驗(yàn)與帖膜試驗(yàn)，可視情況選用。2.7.2 抑菌環(huán)試驗(yàn)2.7.2.1 原 理利用抑菌劑不斷溶解經(jīng)瓊脂擴(kuò)散形成不同濃度梯度，以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)通過(guò)抑菌環(huán)大小以判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于抑菌劑與溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的抗（抑）菌效果鑒定。 2.7.2.2 實(shí)驗(yàn)器材 （1）實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（8099 或ATCC 112

2、29）、白色念珠菌（ATCC 10231）菌懸液（見(jiàn) 2.1.2）及根據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌懸液 （2）抑菌劑載體 5mm 直徑圓形新華一號(hào)定性濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽滅菌處理后，置 120 烤干2h，保存?zhèn)溆?（4）微量移液器 5L50L，可調(diào)式 （5）游標(biāo)卡尺 （6）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基與沙堡瓊脂培養(yǎng)基2.7.2.3 操作程序 （1）抑菌片的制備：對(duì)液體抑菌劑，取無(wú)菌并干燥的濾紙片。每片滴加實(shí)際使用濃度抑菌劑溶液 5L，然后將濾紙片平放于清潔的無(wú)菌平皿內(nèi)，開蓋置恒溫培養(yǎng)箱（37）中烤干，或置室溫下自然干燥后備用。 溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品，可直接制成直徑為 5mm，厚不超過(guò)

3、4mm 圓片（塊），每 4 片（塊） 一組。 （2）陰性對(duì)照樣片的制備：取無(wú)菌干燥濾紙片，每片滴加無(wú)菌蒸餾水5L，干燥后備用。 溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的陰性對(duì)照樣本， 應(yīng)取同種材質(zhì)不含抑菌成份的樣品，制成與試驗(yàn)組大小相同的樣片（塊）。 （3）試驗(yàn)菌的接種：用無(wú)菌棉拭子蘸取濃度為 5×105cfu/mL5×106cfu/mL 試驗(yàn)菌懸液，在適宜的培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng) 60°，最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿，置室溫干燥 5min。（4）抑菌劑樣片貼放：每次試驗(yàn)貼放1個(gè)染菌平板，每個(gè)平板貼放4片試驗(yàn)樣片， 1 片陰性對(duì)照樣片，共 5

4、 片。用無(wú)菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各樣片中心之間相距 25mm 以上， 與平板的周緣相距 15mm 以上。貼放好后，用無(wú)菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置 37恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 16h18h 觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑（包括貼片）并記錄。（5）試驗(yàn)重復(fù)3次。 （6）測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無(wú)菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行。測(cè)量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。2.7.2.4 評(píng)價(jià)規(guī)定 （1）抑菌作用的判斷： 抑菌環(huán)直徑大于 7mm 者，判為有抑菌作用。 抑菌環(huán)直徑小于或等于 7mm 者，判為無(wú)抑菌作用。 （2）3 次重復(fù)試驗(yàn)（共12個(gè)樣片）均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。 （3）陰性

5、對(duì)照組應(yīng)無(wú)抑菌環(huán)產(chǎn)生。否則試驗(yàn)無(wú)效。 2.7.2.5 注意事項(xiàng) （1）每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照。在報(bào)告中亦必須將對(duì)照組的結(jié)果列出。 （2）接種用細(xì)菌懸液的濃度應(yīng)符合要求。濃度過(guò)低，接種菌量少，抑菌環(huán)常因之增大；濃度過(guò)高，接種量過(guò)多，抑菌環(huán)則可減小。 （3）應(yīng)保持瓊脂濃度的準(zhǔn)確性，否則可影響抑菌環(huán)的大小。 （4）培養(yǎng)時(shí)間不得超過(guò) 18h。培養(yǎng)過(guò)久，部分細(xì)菌可恢復(fù)生長(zhǎng)，抑菌環(huán)變小。（5）抑菌環(huán)直徑可受抑菌劑的量、抑菌性能和干濕度影響。故抑菌劑濾紙片應(yīng)在試驗(yàn)當(dāng)天制備。2.7.3 最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)（瓊脂稀釋法） 2.7.3.1 原 理 本試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法將不同濃度的抑菌劑混合溶解在瓊脂培養(yǎng)基中，

6、然后點(diǎn)種細(xì)菌，通過(guò)細(xì)菌的生長(zhǎng)與否，確定抗（抑）菌物質(zhì)抑制受試菌生長(zhǎng)的最低濃度，即最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）。本方法適用于非溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品抗（抑）菌效果的鑒定。 2.7.3.2 實(shí)驗(yàn)器材（1）實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大腸桿菌 8099或ATCC 11229，可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株 （2）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，制備后經(jīng)高壓滅后，置 4550水浴備用，此培養(yǎng)基將用于對(duì)照試驗(yàn) （3）磷酸鹽緩沖液 0.03mol/L，pH7.2（4）滅菌蒸餾水（5）加樣器（1L10L）（6）4550水浴恒恒溫培養(yǎng)箱（7）吸

7、管、試管、平皿（8）37恒溫培養(yǎng)箱2.7.3.3 操作步驟（1）抗（抑）菌溶液的配制：以無(wú)菌操作取 5mL或 5g（固體研磨后）樣品，放入 45mL 滅菌蒸餾水中，充分振蕩溶解，配成 10% 的均勻分散的溶液或懸液。（2）抗菌劑稀釋液配制：將已配成 10% 的抗（抑）菌溶液或懸液用蒸餾水做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，置 4550 水浴恒溫備用。 （3）雙倍濃度營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：制備后經(jīng)高壓滅菌后，置 4550 水浴備用，此培養(yǎng)基將用于稀釋抗（抑）菌溶液或懸液。 （4）含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的配制：分別取 10mL 系列稀釋的抗菌液加入平皿內(nèi)。將在 4550 水浴中的雙倍濃度營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 10

8、mL，加進(jìn)平皿內(nèi)，邊加邊搖晃平板，使抗（抑）菌液和培養(yǎng)基充分混勻。 （5）用加樣器取1L2L（含菌量約為 107cfu/mL 的PBS溶液）菌懸液點(diǎn)種于含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的平皿，接種后所形成的菌液圈直徑約 5mm8mm（每個(gè)點(diǎn)菌量約為 104cfu）。（6）以同樣方法接種不含抗（抑）菌成分的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，作為陽(yáng)性對(duì)照。（7）將接種后的平板放置 35 恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng) 18h24h，觀察結(jié)果。2.7.3.4 評(píng)價(jià)規(guī)定菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低抗（抑）菌液濃度為該樣品對(duì)受試菌的MIC。單一菌落生長(zhǎng)可忽略不計(jì)。2.7.3.5 注意事項(xiàng)（1）接種時(shí)，應(yīng)由低抗（抑）菌劑濃度向高濃度平板依次接種，最

9、后接種對(duì)照平板。（2）為了保證平板受熱均勻，培養(yǎng)時(shí)平板堆放不得超過(guò)4個(gè)。2.7.4 最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)（營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋法） 2.7.4.1 原 理 本試驗(yàn)將不同濃度的抑菌劑混合溶解于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后接種細(xì)菌，通過(guò)細(xì)菌的生長(zhǎng)與否，確定抑菌劑抑制受試菌生長(zhǎng)的最低濃度，即最小抑菌濃度（MIC）。本方法適用于溶出性抑菌產(chǎn)品最低抑菌濃度的測(cè)定。 2.7.4.2 實(shí)驗(yàn)器材（1）實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC 6538），大腸桿菌（8099或ATCC 11229），可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株 （2）營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 見(jiàn)附錄A （3）稀釋液 見(jiàn)附錄A （4）吸管、試管 （5）37恒溫培養(yǎng)箱。2

10、.7.4.3 操作步驟（1）按 2.1.2 所示方法制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌懸液 （2）含抗菌劑培養(yǎng)基配制：將抗（抑）菌溶液用蒸餾水做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，取各稀釋度受試液 2.5mL 加入到含 2.5mL 雙倍濃度營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中。（3）取 0.1mL 含菌量約為 108cfu/mL 菌懸液接種于含抗（抑）菌劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為試驗(yàn)組樣本。（4）以同樣方法接種不含抗（抑）菌劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為陽(yáng)性對(duì)照組樣本。（5）取2支含營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管，作為陰性對(duì)照組樣本。（6）將試驗(yàn)組樣本、陽(yáng)性對(duì)照組樣本及陰性對(duì)照組樣本放置 37恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 48h，觀察結(jié)果。（7）試驗(yàn)中

11、應(yīng)將試驗(yàn)用菌懸液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，其作用濃度應(yīng)為 5×105cfu/mL5×106cfu/mL。2.7.4.4 評(píng)價(jià)規(guī)定當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照管有細(xì)菌生長(zhǎng)（混濁），陰性對(duì)照管無(wú)菌生長(zhǎng)（透明），試驗(yàn)用菌懸液的作用濃度為 5×105cfu/mL5×106cfu/mL 時(shí)， 試驗(yàn)組無(wú)菌生長(zhǎng)的最高稀釋度所對(duì)應(yīng)的抗（抑）菌劑濃度，為該樣品對(duì)受試菌的MIC。2.7.4.5 注意事項(xiàng)接種時(shí)，應(yīng)由低抗（抑）菌劑濃度向高濃度依次接種。2.7.5 滯留抑菌效果鑒定試驗(yàn)2.7.5.1 原 理本試驗(yàn)通過(guò)模擬適合細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖和可能產(chǎn)生感染的皮膚條件下，使用隨機(jī)性、雙盲的、配對(duì)比較的方法，檢

12、測(cè)抗（抑）菌樣品12h或24h的滯留抑菌效果。2.7.5.2 實(shí)驗(yàn)器材（1）試驗(yàn)產(chǎn)品 試驗(yàn)品為25套按順序編號(hào)的樣品。每套2塊，一塊為測(cè)試樣品皂，另一塊為不含抗（抑）菌劑的對(duì)照樣品 （2）不含抑菌劑的洗發(fā)液和沐浴液各25瓶（200mL/瓶，試驗(yàn)調(diào)整階段用）（3）不含抑菌劑的香皂 25塊（試驗(yàn)調(diào)整階段用）（4）胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）（5）胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（6）0.075mol/L的磷酸鹽緩沖液 （7）70%酒精（8）恒溫培養(yǎng)箱（9）金屬筒 （直徑2.2cm、高度3cm）（10）一次性接種環(huán)（直徑4mm）（11）小塑料碗（直徑2.2cm、高2.5mm）（12）膠帶（Dar

13、apore，3M公司生產(chǎn)）（13）尼龍刮菌棒（14）Triton-X 100 500ml（15）外用抗生素軟膏（例如：百多邦莫匹羅星軟膏）（16）玻璃彎棒（17）羊血 經(jīng)脫纖維處理（18）金黃色葡萄球菌ATCC 27217（此株金黃色葡萄球菌是一種低毒性、對(duì)青霉素敏感、對(duì)四環(huán)素有抗藥性的色素株，曾用于許多試驗(yàn)研究，沒(méi)有任何嚴(yán)重副作用）。（19）皮膚消毒劑 2.7.5.3 試驗(yàn)步驟（1）調(diào)整階段 試驗(yàn)開始前 7d至 14d， 志愿者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗發(fā)水和沐浴液進(jìn)行日常的洗手、洗澡。此階段持續(xù)至少 7d，但不超過(guò) 14d。（2）清洗階段清洗階段共 3d，志愿者每天用抗（抑）菌樣品清

14、洗一側(cè)前臂， 用對(duì)照樣品清洗另一側(cè)前臂，清洗過(guò)程如下：1）先清洗左臂，用流動(dòng)水（水溫應(yīng)保持在 3537）打濕前臂內(nèi)側(cè)；2） 用香皂從手腕至臂肘上下摩擦15s；3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；4）用流動(dòng)的清水沖洗前臂15s， 不要搓擦；5）用紙巾沾干前臂. 不要搓擦；6）重復(fù)以上步驟清洗右臂；7）按上面所描述的試驗(yàn)步驟每日清洗前臂3次，每次間隔至少一個(gè)小時(shí)，在最后一次清洗之后，需記錄好時(shí)間，在 12h之后，進(jìn)行滯留效果檢測(cè)。在第9次清洗前臂以后，志愿者不能洗澡、淋浴或洗凈前臂，直到試驗(yàn)結(jié)束。清洗前后的兩塊香皂的重量及志愿者完成清洗的情況，須記錄下來(lái)。（3）試驗(yàn)階段清洗階段的第四天（

15、最后一次清洗后 12h或24h），將在志愿者每只前臂上劃出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)，對(duì)試驗(yàn)區(qū)進(jìn)行接種、封包和回收存活細(xì)菌，具體步驟如下:1）將金黃色葡萄球菌（ATCC 27217）連續(xù)轉(zhuǎn)種3代，取第3代培養(yǎng)物接種于胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中，在 35±2 的條件下培養(yǎng) 20h ±2h。然后用胰蛋白酶大豆肉湯適當(dāng)稀釋菌懸液，使菌懸液濃度約為 108cfu/mL109cfu/mL。2）細(xì)菌接種：在志愿者的每只前臂中間部位（不要在手腕和肘皺褶處），用帶有印墨直徑為3.00cm的玻璃量筒扣在皮膚上，劃分出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)。使用加樣器取10L上述菌懸液，接種于前臂試驗(yàn)區(qū)（菌落數(shù)為106cfu/試驗(yàn)

16、區(qū)107cfu/試驗(yàn)區(qū)），用一次性接種環(huán)，把接種物涂成一圓形，使其與試驗(yàn)區(qū)邊緣應(yīng)有 4mm5mm的距離。3）封包：細(xì)菌接種后立即用小塑料碗扣于染菌區(qū)上面 ，再用膠帶將小塑料碗固定在皮膚上，記錄封包的時(shí)間。4）回收存活細(xì)菌：接種后 2h±5min 對(duì)前臂上接種的區(qū)域進(jìn)行取樣。將金屬筒放置于試驗(yàn)區(qū)中間部位，不要接觸到蓋有印墨的邊緣。將 1mL 含0.1% triton-X100的0.075mol/L磷酸鹽緩沖液吸移至金屬筒內(nèi)，用尼龍刮菌棒刮洗金屬筒罩住區(qū)域內(nèi)的皮膚 60s，將筒內(nèi)液體吸移至試管內(nèi)，再加 1mL 含0.1%triton X-100的 0.075mol/L磷酸鹽緩沖液，對(duì)該區(qū)

17、域內(nèi)的皮膚進(jìn)行第二次刮洗 30s，將第二次擦洗的液體，注入含第一次刮洗液體的試管中。5）實(shí)驗(yàn)區(qū)試驗(yàn)后的消毒處理: 一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)采樣之后，需用70% 的酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行消毒。然后對(duì)另一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)以同樣方法進(jìn)行采樣， 采樣結(jié)束后，先用70% 的酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行消毒，然后用皮膚消毒劑對(duì)兩只前臂進(jìn)行消毒處理，處理后清水沖洗，擦干，再涂少量的抗生素軟膏。6）平皿接種與培養(yǎng):對(duì)每一個(gè)取樣進(jìn)行平皿接種，以 0.0375mol/L磷酸鹽緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，選適當(dāng)稀釋度取 0.1mL 接種于2個(gè)含5% 羊血的TSA平板表面，用玻璃彎棒涂勻，在 35±2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h±4h，

18、計(jì)數(shù)菌落數(shù)。 7）以試驗(yàn)同批次的稀釋液、培養(yǎng)基等分別設(shè)陰性對(duì)照。8）抑菌率的計(jì)算抑菌率= （對(duì)照平均菌落數(shù)試驗(yàn)平均菌落數(shù)）/ 對(duì)照平均菌落數(shù) ×100%2.7.5.4 評(píng)價(jià)規(guī)定（1）各次試驗(yàn)陰性對(duì)照菌無(wú)菌生長(zhǎng)。（2）實(shí)驗(yàn)不得少于16人次，抑菌率均 50%，判定該產(chǎn)品在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)有滯留抑菌作用。2.7.5.5 注意事項(xiàng)（1）志愿者錄用標(biāo)準(zhǔn)1）年齡介于18歲至65歲的男性或女性；2）志愿者應(yīng)身體健康；3）前臂應(yīng)完好無(wú)損且沒(méi)有皮膚病及其它皮膚問(wèn)題；4）同意在整個(gè)試驗(yàn)期間，避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部類固醇類藥和全身或局部使用抗生素，除非因?yàn)椴l(fā)病癥醫(yī)生要求使用；5）同意在清洗階段使

19、用非藥物香皂或洗液洗澡和淋浴，但志愿者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂以后，不洗澡，淋浴或洗凈前臂，直到試驗(yàn)結(jié)束。（2）排除志愿者的標(biāo)準(zhǔn) 如果志愿者有下列情況之一，不能被錄用參加試驗(yàn)1）同時(shí)參加另外一個(gè)臨床試驗(yàn)2）在過(guò)去的 14d中，參加過(guò)任何一種形式的關(guān)于清潔手或手臂的試驗(yàn)3）對(duì)香皂、去污劑、香水或青霉素過(guò)敏4）懷孕婦女5）診斷患有糖尿病、肝炎、艾滋病（HIV陽(yáng)性）、器官移植者，（3）其它試驗(yàn)限制1）志愿者不得使用其它清潔用品；2）志愿者應(yīng)避免洗熱水盆浴和游泳；3）志愿者應(yīng)避免接觸未干的油漆、涂料或者其它溶劑；4）志愿者應(yīng)避免在手腕處和前臂上噴灑香水。（4）在試驗(yàn)完成后的 48h72h內(nèi)，需檢

20、查前臂上有無(wú)小膿皰、水皰，隆起的紅色癢皰。出現(xiàn)這些情況的志愿者應(yīng)盡快通知檢驗(yàn)單位。2.7.6 洗衣粉抗（抑）菌效果鑒定試驗(yàn)2.7.6.1 原 理本方法通過(guò)模擬洗衣機(jī)的洗衣過(guò)程，檢測(cè)除（殺）菌洗衣粉（劑）的抗菌作用。2.7.6.2 實(shí)驗(yàn)器材（1）實(shí)驗(yàn)菌株 大腸桿菌（8099或ATCC11229），金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）（2）培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂A 瓊脂含量為1.5%營(yíng)養(yǎng)瓊脂B 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂A中另加入1.5 %的瓊脂 營(yíng)養(yǎng)肉湯胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA） （3）牛血清白蛋白（過(guò)濾除菌）（4）烷基酚聚氧乙烯醚（Tergitol）（5）碳酸鈉 （6）標(biāo)準(zhǔn)硬水（7）非離子浸濕劑（8）沖洗溶液

21、 （9）含0.5 % 吐溫的磷酸鹽緩沖液 （10）吐溫80（過(guò)濾除菌）（11）無(wú)菌去離子水或蒸餾水（12）不銹鋼轉(zhuǎn)軸 由一條直徑0.16cm 不銹鋼絲制成 如圖2-2 （13）有金屬螺蓋的玻璃罐 容積為470mL，可高壓滅菌，并可放入轉(zhuǎn)軸的廣口罐，將罐口覆蓋牛皮紙，加蓋，于121滅菌25min備用（14）轉(zhuǎn)動(dòng)速度為45r/min60r/min 的滾動(dòng)搖床（15）可調(diào)恒溫水浴箱（16）吸管（1mL、5mL、10mL）（17）培養(yǎng)皿（18）鋪有濾紙的玻璃培養(yǎng)皿（19）菌種保存管（20）細(xì)菌培養(yǎng)箱（21）渦流振蕩器（22）細(xì)菌比濁儀（23）棉布 32織紗/cm × 32 織紗/cm 平織棉

22、布 （24）別針、鑷子、無(wú)菌手套、3mm5mm玻璃珠、秒表、載體布片2.5cm×3.75cm 2.7.6.3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（1）測(cè)試棉布的制備1）非離子浸潤(rùn)劑的制備：取 5g 烷基酚聚氧乙烯醚，5g 碳酸鈉加入到1L 去離子水中。2）洗滌液的制備：1.5g 非離子浸潤(rùn)劑，1.5g 碳酸鈉，加入到3L去離子水中。將大約300g 測(cè)試棉布加入3L 洗滌溶液，加熱煮沸1h，取出棉布在煮沸的去離子水中清洗 5min，然后放入涼去離子水中 5min，以去除殘留的浸潤(rùn)劑，然后將棉布晾干。（2）測(cè)試棉布和轉(zhuǎn)動(dòng)支架的準(zhǔn)備：取處理過(guò)的棉布，剪成5cm 寬，重量為15g 1g的布條，將其一端插入固定在測(cè)試轉(zhuǎn)

23、動(dòng)支架的水平方向的外邊，然后在三條水平支架間以足夠的張力纏繞12個(gè)整圈，將布條的另一端用不銹鋼別針固定在前一圈布條上。最后以 121 壓力蒸汽滅菌15min，備用。 （3）細(xì)菌懸液的制備：取0.5mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯凍干的菌種溶解，接種于含10mL 的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管，于 352 培養(yǎng) 24h。 然后振蕩混合均勻。用10L 接種環(huán)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線， 置于 352 培養(yǎng)24h。然后從平板上挑取單個(gè)菌落種入菌種保藏管中，上下?lián)u動(dòng)10次，吸棄多余液體，置 -85冰箱保存。試驗(yàn)前，從菌種保藏管中取出一粒帶菌小顆粒放入營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，晃動(dòng)斜面。將斜面至 35 培養(yǎng)24h。每天轉(zhuǎn)種1次，連續(xù)傳三代。第四天，用

24、5mL PBS洗脫斜面上的菌苔， 取 0.5mL 加入到含 9.5mL PBS的試管中，混勻，取1mL2mL 加入含有 20mL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂B的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使菌液覆蓋整個(gè)瓊脂表面。吸棄多余菌液，然后將培養(yǎng)瓶倒置平放在 35 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。用5mL PBS和 3g 滅菌玻璃珠洗脫細(xì)胞瓶中的菌體，用PBS調(diào)整濃度至1×108cfu/mL5×108cfu/ml，然后加入等量 3.0% 的牛血清白蛋白。（4）染菌載體的制備：每片載體接種20L菌懸液，放回培養(yǎng)皿中，加蓋，于 352 在培養(yǎng)箱中干燥 20min。 （5）測(cè)試樣品的制備：至少在實(shí)驗(yàn)開始前 20min， 將

25、盛有 265mL 硬水的玻璃罐在水浴箱中恒溫至測(cè)試溫度（251）。加入被測(cè)試樣品混合溶解。 2.7.6.4 實(shí)驗(yàn)步驟（1）將2片染菌載體放入轉(zhuǎn)動(dòng)支架的第 6 和 7 層布條之間，將第3片放入第 7 和 8 層布條之間。（2）以無(wú)菌操作方式將轉(zhuǎn)動(dòng)單元（支架、布條和染菌載體）放入含有測(cè)試產(chǎn)品的玻璃罐中， 加蓋。（3）玻璃罐固定在搖床上，滾動(dòng)旋轉(zhuǎn)洗滌20min，取下玻璃罐。 （4）以無(wú)菌操作方式，取出轉(zhuǎn)動(dòng)單元，取出3片染菌載體，放入到含有 30mL 含0.5% 吐溫80的PBS）的試管中，在振蕩器中混合10s。然后振打200次， 用PBS做10倍系列稀釋，并選擇適宜稀釋度樣液接種TSA平板。每個(gè)稀釋

26、度接種2個(gè)平板。（5）對(duì)照組除用 0.5% 吐溫80替代測(cè)試產(chǎn)品外，其它實(shí)驗(yàn)條件和步驟均與試驗(yàn)組相同。（6）菌數(shù)對(duì)照：將3片染菌載體加入含有30mL 0.5% 吐溫80 的PBS試管中，在振蕩器振蕩10s，然后振打80次， 用PBS做系列10倍稀釋，并取適宜稀釋度樣液 1.0mL，以傾注法接種TSA平板，每個(gè)稀釋度接種2兩個(gè)平板。（7）將試驗(yàn)組、對(duì)照組和菌數(shù)對(duì)照組平板倒置于 35±2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h ± 4h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。（8）以試驗(yàn)同批次的稀釋液、培養(yǎng)基等分別設(shè)陰性對(duì)照。（9）結(jié)果計(jì)算試驗(yàn)重復(fù)3次。記錄并計(jì)算測(cè)試樣品的細(xì)菌總數(shù)，求其平均值。用下列公式計(jì)算除菌率：抑菌率

27、（%）=（A-B）/A ×100% 其中A為實(shí)驗(yàn)前對(duì)照樣品的菌落數(shù)；B為試驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)樣品的菌落數(shù)。2.7.6.5 評(píng)價(jià)規(guī)定各次陰性對(duì)照均無(wú)菌生長(zhǎng)，對(duì)照組回收菌數(shù)應(yīng)為1×106cfu/片5×106cfu/片，抑菌率達(dá)到50%者，判定為有抗菌作用。2.7.6.6 注意事項(xiàng)（1）將旋轉(zhuǎn)單元放入玻璃罐后應(yīng)將蓋子蓋緊，以防轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)漏水。（2）試驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，以防止雜菌污染。2.7.7 振蕩燒瓶試驗(yàn)2.7.7.1原 理在液體中通過(guò)快速長(zhǎng)時(shí)間振蕩， 增加微生物與抗（抑）菌產(chǎn)品內(nèi)抑菌劑的接觸以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)根據(jù)抑菌率大小判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于對(duì)非溶出性抗（抑

28、）菌織物的抗（抑）菌效果鑒定。2.7.7.2實(shí)驗(yàn)器材（1）實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（8099）、白色念珠菌（ATCC 10231） 菌懸液的制備方法見(jiàn)2.1.2。根據(jù)抑菌劑特定用途也可用其他菌懸液 （2）磷酸鹽緩沖液（PBS，0.03mol/L，pH值7.2）（3）振蕩搖床 （300r/min）（4）三角燒瓶（5）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）與沙堡瓊脂培養(yǎng)基2.7.7.3 操作程序（1）將抗菌物品剪切成 10mm×10mm 樣片，稱取 0.75g 2份分別置入 250mL 的三角燒瓶中。（2）在上述三角燒瓶中加入 70mL PBS和

29、 5mL菌懸液，使菌懸液在PBS中的濃度為1×104cfu/mL5×104cfu/mL。（3）將三角燒瓶固定于振蕩搖床上，在作用溫度為 2025 的條件下，以300r/min分別振搖 2min、1h。吸取 1.0mL 用PBS作適當(dāng)稀釋至10-2，作為試驗(yàn)組振蕩前樣液。（4）分別吸取振蕩前和振蕩后樣液及適當(dāng)稀釋度的稀釋液各 1.0mL，以瓊脂傾注法接種平皿，每個(gè)樣液接種2個(gè)平皿，按照2.1.3規(guī)定的方法進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（5）試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照樣片和不加樣片組。對(duì)照樣片組以不含抗菌劑的材質(zhì)、大小相同的樣片代替抗菌樣片外， 其它操作程序均與實(shí)驗(yàn)組相同。 不加樣片組分別取 5m

30、L菌懸液和 70mL PBS加入 250mL 三角燒瓶中，混勻，分別于振蕩前和振蕩后 1h，各取 1.0mL 菌懸液與PBS的混合液做適當(dāng)稀釋。同上，按2.1.3法進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（6）以試驗(yàn)同批次的稀釋液、培養(yǎng)基分別設(shè)陰性對(duì)照。（7）試驗(yàn)重復(fù)3次，按下式計(jì)算抑菌率抑菌率=（樣品振蕩前平均菌落數(shù)-樣品振蕩后平均菌落數(shù)）/樣品振蕩前平均菌落數(shù)×100%2.7.7.4 評(píng)價(jià)規(guī)定 （1）各次試驗(yàn)陰性對(duì)照均應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。（2）不加樣片組活菌計(jì)數(shù)在 1×104cfu/mL5×104cfu/mL之間， 且樣本振蕩前后平均菌落數(shù)差值在 10% 以內(nèi)， 試驗(yàn)有效。（3）各次試驗(yàn)中

31、，試驗(yàn)樣片抑菌率與對(duì)照樣片抑菌率的差值菌26%， 即判定該產(chǎn)品具有抗菌作用。2.7.7.5注意事項(xiàng)振蕩前須將振蕩搖床上的三角燒瓶固定牢，以免碰破。試驗(yàn)中，在實(shí)驗(yàn)誤差允許的范圍內(nèi)，如果試驗(yàn)組和對(duì)照組出現(xiàn)振蕩后菌落數(shù)高于振蕩前菌落數(shù)的情況，其抑菌率可按“0”計(jì)算。2.7.8 浸漬試驗(yàn)2.7.8.1 原 理將試樣和對(duì)照織物分別放于三角瓶中，用含有肉湯培養(yǎng)基的試驗(yàn)菌懸液接種于試樣和對(duì)照織物上，經(jīng)培養(yǎng)后，分別將培養(yǎng)前后試樣上的細(xì)菌洗下，測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量，可計(jì)算出試樣上細(xì)菌減少的百分率。該方法適用于溶出性抗菌織物抗（抑）效果的檢測(cè)。2.7.8.2 實(shí)驗(yàn)器材（1）實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）

32、（2）試樣 在距試樣布邊 10cm 以上、離布端 1m 以上部位，剪取直徑為 5cm 的圓形試樣若干（需用試樣數(shù)量要根據(jù)纖維類別及織物織法而定，以能吸收1ml 菌液且三角瓶中不留殘液為度）。另同法剪取對(duì)照織物若干，取 3 份試樣和 2 份對(duì)照織物分別裝于三角瓶中，蓋好瓶口，121 15min滅菌備用（3）肉湯培養(yǎng)基（4）胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（5）磷酸鹽緩沖液（PBS，0.03mol/L，pH為7.27.4）（6）恒溫水浴箱（7）37培養(yǎng)箱2.7.8.3 菌懸液的制備用接種環(huán)將保存的菌種以劃線法接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，在 37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，取平皿上典型的菌落移種到含肉湯培養(yǎng)基的三角瓶

33、中，在 37條件下培養(yǎng) 24h，用肉湯對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行系列稀釋，使菌懸液的含菌量為 1×105cfu/mL5×105cfu/mL。2.7.8.4 試驗(yàn)步驟（1）分別取 1mL 菌懸液加在 3 份準(zhǔn)備好的三角瓶?jī)?nèi)的織物上，確保其均勻分布，且三角瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸發(fā)。（2）分別在一個(gè)盛有試樣和對(duì)照織物的三角瓶中加入 100mL 緩沖液，劇烈搖晃 1min 洗滌細(xì)菌，取 1mL 做系列1 0倍稀釋，選適當(dāng)稀釋度以傾注法接種平皿，作為“0”接觸時(shí)間樣品和對(duì)照織物上的細(xì)菌數(shù)。 （3）將另一個(gè)裝有接種試樣的三角瓶在 37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 20h±2h，然后加入 10

34、0mL緩沖液，劇烈搖晃 1min 洗滌細(xì)菌，取 1mL 做系列10倍稀釋，選適當(dāng)稀釋度以傾注法接種平皿，作為試驗(yàn)組。 （4）試樣不接種菌懸液，在“0”接觸時(shí)間加入 100mL 緩沖液，劇烈搖晃 1min 取樣，接種平皿，作為陰性對(duì)照組。（5）另取1個(gè)裝有對(duì)照織物的三角燒瓶，接種 1mL 菌懸液后，在 37 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h±2h，然后加入 100mL 緩沖液，劇烈搖晃 1min 洗滌細(xì)菌，取 1mL 做系列10倍稀釋，選適當(dāng)稀釋度以傾注法接種平皿，作為陽(yáng)性對(duì)照組。（6）將陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣本與試驗(yàn)組樣本一并放入 37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。（7）試驗(yàn)重復(fù)3次。（8）結(jié)

35、果計(jì)算 B或C或（BC）/2-A抑菌率（%）= ×100B或C或（BC）/2 試驗(yàn)組試樣上的細(xì)菌數(shù)；“0”接觸時(shí)間試樣上的細(xì)菌數(shù)；“0”接觸時(shí)間對(duì)照織物上的細(xì)菌數(shù)；如果“B”和“C”差別較大時(shí)，取較大值；如果“B”和“C”差別不大時(shí)，取平均值。2.7.8.5 評(píng)價(jià)規(guī)定“0”接觸時(shí)間對(duì)照織物的平均菌落數(shù)應(yīng)在 1×103cfu/mL5×103cfu/mL。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照菌數(shù)比“0”接觸時(shí)間的菌數(shù)明顯增加。各次試驗(yàn)的抑菌率均50%，即判定該樣片具有抗菌作用。2.7.8.6 注意事項(xiàng)對(duì)織物進(jìn)行染菌操作時(shí)，應(yīng)確保其均勻分布，且三角瓶中不沾染或存留多余菌液。三角

36、瓶?jī)?nèi)的織物染菌后，應(yīng)將瓶口封好，以防液體蒸發(fā)，造成細(xì)菌死亡。2.7.9 貼膜試驗(yàn)2.7.9.1 原 理本方法是通過(guò)將細(xì)菌污染于抗菌制品表面，然后用塑料薄膜覆蓋，使細(xì)菌與抗菌制品表面充分接觸，以測(cè)定其抗菌效果。適用于抗菌塑料、抗菌地板、抗菌瓷磚等產(chǎn)品的抗（抑）菌效果測(cè)定。2.7.9.2 實(shí)驗(yàn)器材（1）實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（8099）、白色念珠菌（ATCC 10231），也可根據(jù)抑菌劑特定用途選用其他菌株（2）磷酸鹽緩沖液（3）培養(yǎng)基 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）與沙堡瓊脂培養(yǎng)基（4）薄膜 不影響細(xì)菌生長(zhǎng)和不吸水的材料，厚度不規(guī)定，使用