人臍血間充質干細胞體外終末分化為神經(jīng)元樣細胞

1、人臍血間充質干細胞體外終末分化為神經(jīng)元樣細胞 11-01-30 16:17:00 作者：夏桂枝編輯：studa20【摘要】 目的: 探討人臍血間充質干細胞體外培養(yǎng)過程中的終末分化方向。方法: 采用密度梯度離心法從人臍血中分離培養(yǎng)間充質干細胞, 流式細胞術（FCM）檢測細胞表面抗原標記CD29、 CD44、 CD105、 CD34、 CD106和HLADR; 觀察人臍血間充質干細胞在體外培養(yǎng)過程中的增殖情況和形態(tài)變化, 應用RTPCR和免疫細胞化學方法對P2和P10代人臍血間充質干細胞進行神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和神經(jīng)絲蛋白（NF）的表達情況進行檢測。結果: RTPCR分析證實P10代人臍

2、血間充質干細胞有NSE、 NF的mRNA表達, 免疫細胞化學檢測顯示P10代細胞能表達NSE和NF, 而P2代人臍血間充質干細胞經(jīng)RTPCR和免疫細胞化學檢測均無NSE、 NF表達。結論: 人臍血間充質干細胞在體外培養(yǎng)過程中能終末分化為神經(jīng)元樣細胞。 【關鍵詞】 間充質干細胞 人臍血 分化 神經(jīng)元間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC) 是目前備受關注的一類具有多向分化潛能的組織干細胞, 最先發(fā)現(xiàn)于骨髓, 隨后在臍血和其他組織中也發(fā)現(xiàn)了MSC。研究報道MSC在體外誘導條件下不僅可分化為成骨細胞、 成軟骨細胞、 脂肪細胞和成肌細胞等多種中胚層來源的間質細胞1, 而且

3、還能跨胚層橫向分化為神經(jīng)細胞2。我們在分離培養(yǎng)人臍血MSC的過程中發(fā)現(xiàn)部分臍血MSC在體外培養(yǎng)多次傳代的過程中未經(jīng)誘導表現(xiàn)為類似神經(jīng)元的形態(tài), 因此采用RTPCR和免疫細胞化學的方法對臍血MSC能否表達神經(jīng)元特異性抗原標記進行檢測。1 材料和方法1.1 材料 淋巴細胞分離液（1.077 g/mL）購自中科院天津血液病研究所; DMEMLG培養(yǎng)基購自Sigma公司; 胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司; 青/鏈霉素、 谷氨酰胺、 2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA購自Gibico公司; 鼠抗人CD29FITC、 CD44FITC、 CD105FITC、 CD34FITC、

4、CD106FITC、 HLADRPE單克隆抗體(mAb)及同型對照購自Coulter公司; 鼠抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase, NSE）和神經(jīng)絲蛋白（neurofilament, NF）mAb工作液, EliVisionTM Plus試劑盒購自北京中杉生物技術公司。1.2 方法gaagaaaaggcctgcaactg3, 5ccaggtcagcaatgaatgtg3; NF引物為: 5atcggtaaaggtgcacttgg3, 5tctacctccccattgacagc3。擴增片段長度分別為157 bp和168 bp。Hanks液等體積稀釋。取數(shù)個50

5、 mL的無菌帶蓋離心管, 先加入1.077 g/mL的淋巴細胞分離液25 mL, 無菌滴管吸取稀釋后的臍血25 mL, 離液面約1 cm處緩慢加入, 形成一明顯的界面。2 000 r/min離心20 min, 小心吸取中間的白膜層。加入5倍體積的PBS緩沖液, 1 000 r/min離心10 min, 洗滌3次, 棄上清。所得單個核細胞用于細胞培養(yǎng)。LG培養(yǎng)液中, 置于37、 50 mL/L CO2和飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。57 d后首次換液, 懸浮的細胞被去除, 可見瓶底有少量的貼壁細胞。換上新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。開始每隔57 d換液1次, 待細胞克隆出現(xiàn)、 擴大后根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化

6、每35 d換液1次。待細胞克隆不再擴大生長時即開始傳代, 加入2.5 g/L胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA消化液, 37孵育68 min, 200 mL/L 的胎牛血清終止消化, 按13的比例接種至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。FITC、 CD44FITC、 CD105FITC、 CD34FITC、 CD106FITC和HLADRPE。FCM檢測后, 應用SystemSoftware Version 3.0獲取、 分析檢測結果。PCR檢測: P2和P10代細胞接種于6孔板, 培養(yǎng)達到80%以上融合后, 參照TRIzol RNA抽提試劑盒說明書抽提細胞總RNA, 按照Promega RTPCR試劑

7、盒說明書合成細胞總cDNA（actin作為內參照）。NSE、 NF基因片段的PCR擴增采用50 L反應體系: 10PCR緩沖液5 L, dNTP 4 L, 模板DNA（cDNA）5 L, 上游引物（20 mol/L）1 L, 下游引物（20 mol/L）1 L, DNA聚合酶1 L, ddH2O 33 L。離心混勻, 94預變性5 min后, 按下列參數(shù): 94 30 s, 55 30 s, 72 30 s, 共30個循環(huán)。最后一個循環(huán)結束后72延伸5 min。(2)免疫細胞化學檢測: 分別取P2代和P10代臍血分離細胞, 以5106/L的密度接種于放置有消毒蓋玻片的6孔板內, 每孔加入2 m

8、L新鮮培養(yǎng)液, 制備細胞爬片。細胞貼壁后, 吸出培養(yǎng)液, 小心加入PBS輕輕沖洗2次后, 再加入40 g/L多聚甲醛室溫固定1520 min。PBS輕洗2次, 然后參照EliVisionTM Plus試劑盒說明書進行免疫細胞化學染色。2 結果2.1 臍血分離細胞的培養(yǎng)和傳代 原代培養(yǎng)的細胞剛接種時呈圓形, 4872 h后開始有極少量細胞貼壁, 57 d后出現(xiàn)較多的貼壁細胞, 部分為成纖維細胞狀的長梭形細胞和少量紡錘狀細胞（圖1A）。12 周后可見13個細胞克隆出現(xiàn), 細胞排列成束狀、 漩渦狀或放射狀（圖1B）。23周左右細胞克隆不再向周圍擴大, 按13的比例傳代后細胞擴增明顯加快, 710 d

9、達到90%以上融合, 為均勻一致的成纖維細胞狀細胞。P2P7代細胞增殖速度最快, 13傳代后35 d即達到90%以上融合, P8代細胞增殖速度開始變慢, P10代以后細胞增殖能力明顯下降。相差顯微鏡下觀察, P2代細胞表現(xiàn)為均勻一致的成纖維細胞樣的形態(tài), P3代開始偶見個別細胞表現(xiàn)為類似神經(jīng)元的形態(tài), 隨著傳代次數(shù)增加這種細胞的數(shù)量有增多的趨勢。圖1 人臍血分離細胞的形態(tài)（400）（略）A: 培養(yǎng)7 d的分離細胞; B: 克隆化生長的分離細胞.2.2 臍血分離細胞表面抗原的FCM檢測 檢測結果顯示臍血分離細胞強表達CD29、 CD44、 CD105, 陽性細胞百分數(shù)分別為97.8%、 99.5%、 98.3%; 不表達CD34、 HLADR、 CD106, 陽性細胞百分數(shù)分別為0.09%、 0.82%、 0.12%（圖2）。2.3 臍血MSC向神經(jīng)元樣細胞