簡(jiǎn)便快速獲取人膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因的PCR方法

1、    簡(jiǎn)便快速獲取人膠質(zhì)細(xì)胞源神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因的PCR方法        【摘要】目的：建立簡(jiǎn)便快速地獲取人膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）基因的PCR方法。方法：根據(jù)從GeneBank中調(diào)出的人GDNF基因全序列設(shè)計(jì)引物，提取人基因組DNA做模板行PCR， 經(jīng)酶切和凝膠電泳鑒定產(chǎn)物。結(jié)果：擴(kuò)增出425bp的人GDNF基因，經(jīng)EcoR I酶切可見(jiàn)預(yù)期的341bp片段，證實(shí)獲得正確的產(chǎn)物。結(jié)論：成功建立了一種簡(jiǎn)便快速地從人基因組DNA獲取人GDNF基因的PCR方

2、法，避免了其他作者為獲得GDNF基因而采取收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR等較為繁瑣的步驟，省時(shí)省力，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。【關(guān)鍵詞】人膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 基因組DNAPCR 1993年Lin1等從膠質(zhì)細(xì)胞中分離出一類(lèi)新型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，能顯著促進(jìn)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)存活，故稱(chēng)膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line derived-neurotrophic factor,GDNF）。迄今研究表明GDNF對(duì)多巴胺能神經(jīng)元、去甲腎上腺素能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和前腦膽堿能神經(jīng)元等都有營(yíng)養(yǎng)作用，GDNF在神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型中所取得的效果表明它可望用于治療一系列神經(jīng)變性疾病，如帕金森病、

3、與膽堿能神經(jīng)元衰退相關(guān)的癡呆癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥及其它運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性疾病等2，3。最近還發(fā)現(xiàn)GDNF能防止腦缺血后的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡4，提示它也可望用于治療腦卒中。因此，我們建立簡(jiǎn)便快速地?cái)U(kuò)增人GDNF基因的PCR方法，為人GDNF因基的克隆和表達(dá)及臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。1材料與方法1材料GDNF上游引物：5CGGGATCCATGTCACCAGATAAACAAATG3 BamH I下游引物：5CGGGATCCTCAGATACATCCACACCT3 BamH I由TaKaRa公司合成。Taq DNA polymerase購(gòu)自TaKaRa公司，EcoR1和Marker /EcoR I-Hind III

4、購(gòu)自華美公司。2方法2.1提取人基因組DNA：收集人外周血白細(xì)胞，加入2ml TE(20mM Tris pH8.0, lmM EDTA)懸浮細(xì)胞，再加入0.5% SDS，100mg/L蛋白酶K，37水浴消化2小時(shí)，加入等體積酚氯仿抽提，取上相加入2倍體積無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇洗，空氣干燥后溶于無(wú)菌水中，即獲得人基因組DNA。2.2PCR擴(kuò)增：50l反應(yīng)體系中10x buffer(含Mg2+)5l，2.5mM dNTPs 4l，5M上下游引物各2.5l，人基因組DNA100ng,Taq DNA polymerase U。循環(huán)條件為941分鐘，541分鐘，721分鐘，擴(kuò)增30次。2.3擴(kuò)增產(chǎn)物的

5、鑒定：取8l擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1l10x buffer, 1l EcoR I(14U/l)，37水浴消化2小時(shí)。取消化的擴(kuò)增產(chǎn)物及未消化的擴(kuò)增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以 /EcoR I-Hind III為分子量標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果1PCR擴(kuò)增人GDNF基因注：1:/EcoR I-Hind III Marker,2:擴(kuò)增的人GDNF基因片段，3: EcoR I酶切人GDNF基因片段，4：PCR陰性對(duì)照由1可見(jiàn)，人基因組DNA經(jīng)我們建立的PCR方法擴(kuò)增后，得到425bp大小片段，該片段經(jīng)EcoR I消化后可見(jiàn)341bp的片段，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相吻合。3討論自GDNF被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，此項(xiàng)研究領(lǐng)域非?；钴S。目前國(guó)內(nèi)已

6、有幾家在開(kāi)展這方面的工作，他們均是收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本，提取其RNA后行逆轉(zhuǎn)錄PCR而得到GDNF基因5、6。我們通過(guò)分析得知人GDNF基因并不含有內(nèi)含子，因而認(rèn)為以人基因組DNA為模板即可通過(guò)PCR獲取編碼完整GDNF蛋白的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示我們獲得400bp大小的片段，與其他作者報(bào)道：用逆轉(zhuǎn)錄PCR得到的GDNF基因大小一致，從而證實(shí)了我們?cè)O(shè)計(jì)的正確性。在引物的設(shè)計(jì)方面，我們從GgneBank 中調(diào)出人GDNF基因的全序列485bp，其中81-482bp編碼成熟的GDNF蛋白，152bp有單一的EcoR I酶切位點(diǎn)。Lin等的研究結(jié)果顯示編碼成熟的GDNF蛋白的這段片段可在原核系統(tǒng)中表達(dá)，且

7、有生物學(xué)活性1。因此，我們針對(duì)81-428 bp片段設(shè)計(jì)引物，上游引物為81-98bp，前面加上ATG這一翻譯起始密碼，下游引物為468-482bp，后面加上TGA這一翻譯終止密碼，引物5端加上BamH I識(shí)別序列及修飾堿基，以利于下一步的克隆。總之，我們成功建立了一種簡(jiǎn)便快速地?cái)U(kuò)增人GDNF基因的PCR方法，免除了收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄等較為繁瑣的步驟，省時(shí)省力，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，為我們下一步研究工作的開(kāi)展提供了有利條件。張玲（430060武漢，湖北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）王穎群（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心）吳佐泉（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心）余紹祖（430060武漢，

8、湖北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）參 考 文 獻(xiàn)1，Lin LF,Doherty DH,Lile JD,et al. GDNF,a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.Science, 1993,260:11302，Gash DM, Zhang Z, Ovadia A, et al. Functional recovery in Parkinsonian monkeys treated with GDNF. Nature, 1996,380:2523，Gash DM. Neuroprotective and neurorestorative properties of GDNF.Ann Neurol science, 1998,44(3 Suppl 1):S1214，Miyazaki H, Okuma Y, Fujii Y, et al. Glial cell line-derive