重癥肌無力大鼠膈肌運動終板的形態(tài)學研究

1、    作者：劉睿李柱一張琪王桂平劉津平鞠躬 【關鍵詞】  重癥肌無力Research on morphological changes of end plates in diaphragm of experimental autoimmune myasthenia gravis rats【Abstract】 AIM： To study the pathological characteristics of the end plate on diaphragm in experimental autoimmune myasthenia

2、 gravis animal model by light microscopy and electron microscopy. METHODS:   Passively transferred myasthenia gravis animal model was prepared by injection of acetylcholine receptor monoclonal antibody mAb35, and the ultrastructure of the end plates was studied by acetylcholinesterase hist

3、ochemical technique. RESULTS:  Myasthenia symptoms were induced in the experimental group. The end plates of diaphragm showed ultrastructural changes similar to those of myasthenia gravis patients but no change was found in the number of the end plates. No changes were observed in the cont

4、rol group. CONCLUSION:  It is suggested that the ultrastructural changes of the end plates on diaphragm may result in the dyspnea in experimental autoimmune myasthenia gravis.【Keywords】 myasthenia gravis; acetylcholinesterase;receptors,cholinergic;motor endplate; ultrastucture【摘要】 目的: 

5、; 探討重癥肌無力大鼠膈肌運動終板的光鏡及電鏡結構變化.方法:  被動轉(zhuǎn)移乙酰膽堿受體單抗mAb35建立SD大鼠獲得性自身免疫性重癥肌無力模型，用乙酰膽堿酯酶法顯示膈肌運動終板，并行超微結構觀察.結果:  實驗組大鼠注射mAb35后出現(xiàn)明顯肌無力癥狀，其膈肌運動終板數(shù)量基本不變，但出現(xiàn)與重癥肌無力患者相似的超微結構變化，對照組則無明顯變化.結論:  膈肌出現(xiàn)運動終板超微結構的改變，是重癥肌無力被動轉(zhuǎn)移模型大鼠呼吸衰竭的可能原因.【關鍵詞】 重癥肌無力；乙酰膽堿酯酶；受體，膽堿能；運動神經(jīng)肌肉終板；超微結構0引言重癥肌無力(M

6、G)是運動終板處最常見的疾病，是一種神經(jīng)肌肉傳遞障礙的獲得性自身性免疫疾病，臨床特征為部分或全身骨骼肌易于疲勞.該病死亡率高，患者最常見的死亡原因為呼吸衰竭,常在幾個小時內(nèi)發(fā)展至死亡.膈肌是人體最主要的呼吸肌，我們試圖對重癥肌無力模型大鼠膈肌運動終板的光鏡和電鏡結構進行研究，為重癥肌無力患者發(fā)生呼吸衰竭的機制提供更多的形態(tài)學依據(jù).1材料和方法11材料SD大鼠10只，雌性，體質(zhì)量(200±5)g，鼠齡1012 wk，由本校實驗動物中心提供；乙酰膽堿受體單抗mAb35雜交瘤細胞株（ATCC公司）；乙酰膽堿碘化物（FLUKA公司）.12方法121重癥肌無力被動轉(zhuǎn)移模型的建立參照文獻1的方法

7、制備乙酰膽堿受體單抗mAb35，將SD大鼠隨機分成實驗組和對照組各5只，實驗組按照文獻2的方法建立重癥肌無力被動轉(zhuǎn)移模型： 各只按025 mg/kg ip含mAb35的Ringers液1 mL(140 mmol/L NaCl , 54 mmol/L KCl, 1 mmol/L CaCl2，24 mmol/L NaHCO3 , pH 74)，對照組各只僅注射Ringers液1 mL.122癥狀評估每6 h觀察動物毛色、步態(tài) 、攝食情況，并測量其呼吸頻率及肌力.肌力根據(jù)國際標準以它們抓握、懸吊和行走的情況予以分級3： 0級，肌力完全正常；1級，35次抓握和懸吊實驗后肌力減弱；2級，后肢不完全癱瘓；

8、3級，后肢癱瘓不能站立；4級，垂死狀態(tài)；5級，死亡.123乙酰膽堿酯酶(AChE)法顯示膈肌運動終板42 h后各組大鼠經(jīng)常規(guī)多聚甲醛灌注固定，迅速取下膈肌，制備40 m厚連續(xù)冰凍切片，按照文獻4的方法行膽堿酯酶染色，切片置于乙酰膽堿酯酶孵育液1 h后蒸餾水洗，以不加底物的孵育液作陰性對照，脫水透明封片.在10倍目鏡4倍物鏡下每只動物隨機選取1個視野統(tǒng)計運動終板數(shù)量，以各組5個視野的均值分別代表實驗組和對照組運動終板數(shù)量，用SPSS軟件行t檢驗作統(tǒng)計學分析.124透射電鏡觀察運動終板的超微結構大鼠灌注固定后在含25 g/L戊二醛的后固定液中固定2 h，比照相鄰切片上運動終板多的區(qū)域取材，按常規(guī)電

9、鏡脫水、包埋程序制成500 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色，以JEM2000EX電鏡行透射電鏡觀察.2結果21動物模型癥狀觀察實驗組SD大鼠在注射后8 h開始出現(xiàn)活動減少，毛皺，精神差，動作笨拙，行動遲緩，行走困難不穩(wěn)、對刺激反應遲緩，肌張力低，體質(zhì)量逐漸下降，注射新斯的明可在短時間內(nèi)改善癥狀.24 h始癥狀迅速加重，呼吸頻率增快可達140次/min以上.隨著肌無力程度的加重，呼吸節(jié)律由淺快逐漸發(fā)展至深慢呼吸，呼吸困難不斷加重，類似重癥肌無力患者癥狀，至36 h有約1/3死于呼吸衰竭，對照組則無明顯變化.Fig 1表示實驗組大鼠各時間點癥狀變化情況（分級標準見前材料與方法），可

10、見隨著時間推移實驗組肌無力癥狀進行性加重，對照組肌力完全正常為0級故未標出.圖1實驗組SD大鼠各時間點癥狀變化曲線略圖2膽堿酯酶染色后實驗組和對照組膈肌運動終板的光鏡與電鏡結構22膈肌運動終板的光鏡觀察經(jīng)膽堿酯酶染色后，膈肌上的運動終板清晰可見，鏡下為棕褐色橢圓形或扁平小圈，分布在膈肌外圍區(qū)域，一條肌纖維上只有一個運動終板.實驗組和對照組運動終板數(shù)量每視野分別為(994±96)，(1032±127)，經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計分析后P=06470，兩組運動終板數(shù)量無明顯統(tǒng)計學差異（Fig 1）.23運動終板的電鏡觀察電鏡觀察發(fā)現(xiàn)實驗組膈肌運動終板突觸后膜變平坦，突觸皺折分級減少短縮

11、，突觸間隙增寬，證實了重癥肌無力被動轉(zhuǎn)移模型大鼠膈肌運動終板處發(fā)生超微結構的病理改變(Fig 2).3 討論重癥肌無力是一種典型的獲得性自身免疫性疾病，其臨床特點是活動后加重、休息后減輕的骨骼肌無力；低頻重復電刺激肌電波幅遞減；對膽堿酯酶抑制劑治療有效；免疫學改變是血清乙酰膽堿受體抗體增高；主要病理改變集中在運動終板，表現(xiàn)為突觸后膜的皺摺減少變平坦，其上乙酰膽堿受體減少.近年來研究表明部分MG患者有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的癥狀和體征，神經(jīng)nAChR 與肌nAChR 存在著極高的同源性5，已證實AChRAb可與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)nAChR交叉結合6，因此MG被認為是一種由AChRAb攻擊肌nAChR

12、和神經(jīng)nAChR的泛化的自身免疫性疾病.由于不同個體血中AChRAb可能與不同肌nAChR抗原決定簇結合，同一個體不同部位肌組織提取的nAChR與血中AChRAb反應也存在著差異性，此外，不同部位的骨骼肌功能不同, 其運動終板結構不可能完全一致.而對于臨床MG患者后期最常出現(xiàn)的呼吸衰竭究竟是呼吸肌運動終板發(fā)生了病理變化，還是由于AChRAb與中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)節(jié)處的神經(jīng)nAChR結合造成神經(jīng)性呼吸抑制，對此尚無研究.為此，本研究采用既能與肌nAChR alpha1亞型結合也能與神經(jīng)nAChR alpha3、5亞型結合的乙酰膽堿受體單抗mAb357建立重癥肌無力被動轉(zhuǎn)移模型，以觀察其膈肌的運

13、動終板有無病理改變.本研究中SD大鼠ip mAb35后成功建立了MG被動轉(zhuǎn)移模型，其臨床癥狀、藥理學特點都與MG患者相似，模型大鼠隨著癥狀不斷加重出現(xiàn)了呼吸頻率和節(jié)律的變化，與臨床患者發(fā)生MG危象時呼吸衰竭相似.同時，本研究兩組膈肌的運動終板數(shù)量沒有明顯差異，但實驗組膈肌發(fā)生了與重癥肌無力患者骨骼肌相似的超微結構變化，表現(xiàn)為突觸后膜變平坦，突觸皺折分級減少短縮，突觸間隙增寬，進一步說明了MG模型大鼠的呼吸衰竭與呼吸肌運動終板發(fā)生了病理變化有著極為重要的關系，為MG發(fā)生呼吸衰竭的原因提供了有力的形態(tài)學證據(jù).此外，本研究中采用乙酰膽堿酯酶染色法定位運動終板，比傳統(tǒng)的氯化金浸染法和銀染法易于操作，也

14、比用alpha銀環(huán)蛇毒免疫組化定位簡便快捷，能同時用于光鏡觀察和超微結構研究，也為今后有關運動終板的研究提供了新的方法.【參考文獻】1 金伯泉.細胞和分子免疫學實驗技術M.西安:第四軍醫(yī)大學出版社,2002:15-22.2 Poulas K, Tsouloufis T, Tzartos SJ. Treatment of passively transferred experimental autoimmune myasthenia gravis using papainJ. Clin Exp Immunol, 2000;120:363-368.3 Christadoss P, Poussin

15、M, Deng C. Short analytical review: Animal models of myasthenia gravisJ. Clin Immunol, 2000; 94(2):75-87.4 張琪，顧曉明.神經(jīng)端側縫合術后肌肉的組織學變化J.實用口腔醫(yī)學雜志，1999;15(5):332-334.Zhang Q, Gu XM. Histological observation of target muscle after endtoside neurorrhaphyJ.J Pract Stomatol,1999;15(5)：332-334.5 李柱一，游國雄，鞠躬，等.中

16、樞神經(jīng)煙堿型乙酰膽堿受體研究進展J.第四軍醫(yī)大學學報,1996;17(增刊):1-7.Li ZY, You GX, Ju G, et al. The research evolvement on central nervous nicotinic acetylcholine receptorJ. J Fourth Mil Med Univ,1996;17(Suppl):1-7.6 李柱一，邱曉飛.重癥肌無力乙酰膽堿受體抗體與猴神經(jīng)煙堿型乙酰膽堿受體之間的免疫結合反應J.第四軍醫(yī)大學學報,2001;22（16）:1466-1468.Li ZY, Qiu XF. The Immunoreaction between AChRAb and neuronal nicotinic AChR on monkeyJ. J Fourth Mil Med Univ,2001;22(16) :1466-1468.7 Tzartos SJ, Rand DE, Einarson BL,et al. Mappin