鹽酸頭孢甲肟溶血及血管刺激性實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告注射用鹽酸頭孢甲肟對(duì)家兔的血管刺激性試驗(yàn)及對(duì)家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗(yàn)研究機(jī)構(gòu)名稱： 試驗(yàn)負(fù)責(zé)人： 試驗(yàn)及報(bào)告者： 試驗(yàn)起止日期：研究機(jī)構(gòu)地址： 研究機(jī)構(gòu)電話：委托單位名稱： 委托單位地址： 委托單位聯(lián)系電話：目 錄依從性聲明1QAU陳述2摘要31注射用鹽酸頭孢甲肟對(duì)家兔的血管刺激性試驗(yàn)41.1 樣品制備41.2 動(dòng)物準(zhǔn)備41.3 實(shí)驗(yàn)步驟41.4 結(jié)果41.5 結(jié)果判斷62注射用鹽酸頭孢甲肟對(duì)家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗(yàn)82.1 樣品準(zhǔn)備82.2 動(dòng)物準(zhǔn)備82.3 實(shí)驗(yàn)步驟82.4 結(jié)果92.5 結(jié)果判斷9參考文獻(xiàn)9依從性聲明試驗(yàn)名稱：注射用鹽酸頭孢甲肟對(duì)家兔的血管刺激性試驗(yàn)及對(duì)家兔紅細(xì)胞體外

2、溶血試驗(yàn)試驗(yàn)編號(hào)：本試驗(yàn)是按照中華人民共和國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局局令第2號(hào)，2003年9月1日生效）完成。試驗(yàn)過(guò)程遵照試驗(yàn)方案及本機(jī)構(gòu)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，無(wú)影響試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論可靠性的偏移或其它異常情況。本報(bào)告如實(shí)地反映了試驗(yàn)材料、試驗(yàn)方法和試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)負(fù)責(zé)人： 簽名： 日期： 年 月 日QAU陳述試驗(yàn)名稱：注射用鹽酸頭孢甲肟對(duì)家兔的血管刺激性試驗(yàn)及對(duì)家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗(yàn)試驗(yàn)編號(hào)：試驗(yàn)負(fù)責(zé)人： 為確保試驗(yàn)?zāi)軌驀?yán)格執(zhí)行試驗(yàn)方案的內(nèi)容，并按照本機(jī)構(gòu)SOP操作，QAU對(duì)試驗(yàn)方案、試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程和試驗(yàn)記錄等進(jìn)行了檢查，并審查了原始數(shù)據(jù)、試驗(yàn)報(bào)告，報(bào)告中

3、所述的操作程序、試驗(yàn)方法和試驗(yàn)結(jié)果如實(shí)地反映了試驗(yàn)原始資料的內(nèi)容。QAU檢查項(xiàng)目、檢查日期及報(bào)告日期如下：檢查項(xiàng)目檢查日期報(bào)告試驗(yàn)負(fù)責(zé)人日期報(bào)告機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)人日期試驗(yàn)方案2011.11.022011.11.042011.11.04標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)2011.11.072011.11.092011.11.09試驗(yàn)過(guò)程2011.11.142011.11.162011.11.16試驗(yàn)記錄2011.12.062011.12.082011.12.08原始數(shù)據(jù)2011.12.072011.12.092011.12.09試驗(yàn)過(guò)程2012.01.062012.01.082012.01.08試驗(yàn)記錄92012.

4、01.112012.01.11原始數(shù)據(jù)92012.01.112012.01.11試驗(yàn)報(bào)告2012.01.132012.01.162012.01.16試驗(yàn)QA： 簽名： 日期： 年 月 日QAU負(fù)責(zé)人： 簽名： 日期： 年 月 日摘要本試驗(yàn)包括注射用鹽酸頭孢甲肟（規(guī)格：1 g/瓶）對(duì)家兔的血管刺激性試驗(yàn)及對(duì)家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗(yàn)。注射用鹽酸頭孢甲肟，1 g/瓶，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)100801。本品主要成分為鹽酸頭孢甲肟，為白色至微黃色結(jié)晶性粉末。用法與用量：1.成人：輕度感染：一日1-2g，分2次靜脈滴注；中、重度感染：可增至一日4g，分2-4次靜脈滴注。也可根據(jù)臨床情況進(jìn)行劑

5、量調(diào)整。2.小兒：輕度感染：一日每公斤體重40-80mg，分3-4次靜脈滴注；中、重度感染：可增至一日每公斤體重160mg，分3-4次靜脈滴注；腦脊膜炎：可增量至一日每公斤體重200mg，分3-4次靜脈滴注。在對(duì)家兔的血管刺激性試驗(yàn)中，使用家兔9只，采用同體左右側(cè)自身對(duì)照。于家兔的左耳靜脈注射給予生理鹽水（9mg/ml），相同給藥容量供試品或上市品（20mg/ml）于家兔的右耳靜脈注射給予。每天給藥一次，連續(xù)給藥7天。于每天給藥前以及最后一次給藥后48小時(shí)進(jìn)行臨床觀察和給藥局部觀察，于給藥完成后48小時(shí)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，按血管刺激實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)。試驗(yàn)過(guò)程中，注射用鹽酸頭孢甲肟按臨床成人最大用藥

6、濃度給藥，每日1次兔耳緣靜脈注射，每次20mg/ml，連續(xù)7天，肉眼及組織學(xué)檢查相較生理鹽水組均未見(jiàn)異常，無(wú)刺激性。兩側(cè)對(duì)比無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，注射用鹽酸頭孢甲肟采用20mg/ml濃度靜脈注射對(duì)家兔耳緣靜脈無(wú)刺激作用。家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗(yàn)中，設(shè)置5個(gè)供試品組及陽(yáng)性和陰性對(duì)照組。開始時(shí)每隔15分鐘觀察一次，1小時(shí)后，每隔1小時(shí)觀察一次，觀察3小時(shí)，觀察紅細(xì)胞溶解及凝聚情況。試驗(yàn)過(guò)程中，陰性對(duì)照管無(wú)溶血和凝聚發(fā)生，陽(yáng)性對(duì)照管有溶血發(fā)生，供試品組管中的溶液在3小時(shí)內(nèi)未發(fā)生溶血和凝聚，紅細(xì)胞形態(tài)正常。結(jié)果表明，注射用鹽酸頭孢甲肟在本試驗(yàn)條件下不產(chǎn)生溶血或紅細(xì)胞聚集作用。本試驗(yàn)根據(jù)化學(xué)藥物刺激性、過(guò)

7、敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則的要求，進(jìn)行了注射用鹽酸頭孢甲肟特殊安全性試驗(yàn)，供臨床參考。1注射用鹽酸頭孢甲肟對(duì)家兔的血管刺激性試驗(yàn)1.1 樣品制備供試品為重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的注射用鹽酸頭孢甲肟（批號(hào)100801），對(duì)照上市品為Takeda Phamaceutical Company Lmited, Hikan Plant.生產(chǎn)(批號(hào)：HK566；進(jìn)口藥品注冊(cè)號(hào)：H20090190)。分別用0.9%氯化鈉注射液配制成20 mg/mL的溶液。陰性對(duì)照品0.9%氯化鈉注射液，由西南藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào) 11111019）。1.2 動(dòng)物準(zhǔn)備日本大耳白兔，體重2-2.5 kg，購(gòu)于第三軍醫(yī)

8、大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2007-015，使用許可證號(hào)：SYXK（軍）2007-037。試驗(yàn)前于動(dòng)物房飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。1.3 實(shí)驗(yàn)步驟給藥：供試品組使用家兔6只，于家兔的左耳靜脈注射給予生理鹽水，相同給藥容量供試品（20mg/ml）于家兔的右耳靜脈注射給予。上市品組使用家兔3只，給藥劑量同供試品組。供試品及上市品組給藥容積均為5mL /kg。用6號(hào)頭皮針于耳緣靜脈注射給藥，針尖穿刺血管的方向?yàn)橛蛇h(yuǎn)心端至近心端，給藥速度為2-3mL/分鐘。每天給藥一次，連續(xù)給藥7天。觀察：于每天給藥前以及最后一次給藥后48h對(duì)動(dòng)物和注射部位進(jìn)行肉眼

9、觀察，于給藥完成后48小時(shí)行病理組織學(xué)檢查，按血管刺激實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。1.4 結(jié)果各組每次給藥前以及末次給藥后48 h，肉眼觀察注射部位，實(shí)驗(yàn)側(cè)（右側(cè)）僅見(jiàn)血管輕度擴(kuò)張，無(wú)明顯充血、淤血，紋路清晰，周圍組織無(wú)水腫，與生理鹽水側(cè)（左側(cè)）比較無(wú)差別，記分為零。換算成相應(yīng)的反應(yīng)級(jí)分值見(jiàn)表2。單次觀察累計(jì)得分為0，無(wú)刺激性（圖1）。表1. 血管刺激試驗(yàn)記分觀察方法血管刺激性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)血管刺激性判斷標(biāo)準(zhǔn)觀察指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)得分累計(jì)得分判斷標(biāo)準(zhǔn)肉 眼血管正常00.5無(wú)刺激性血管輕度充血發(fā)紅，紋路清晰1血管充血發(fā)紅，紋路不清晰22.5輕度刺激性血管重度充血，呈紫紅色3周圍組織無(wú)水腫04.5中度刺激性

10、輕微水腫1明顯水腫24.5重度刺激性重度水腫3光 鏡血管內(nèi)皮及血管壁完整00.5無(wú)刺激性內(nèi)皮損傷1血管栓塞22.5輕度刺激性血管破裂3周圍組織正常04.5中度刺激性水腫1出血24.5重度刺激性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)3 表2 血管刺激試驗(yàn)肉眼觀察記分表分組兔號(hào)1st2nd3rd4th5th6th7th7th后48h右左右左右左右左右左右左右左右左供試品組血管100000000000000002000000000000000030000000000000000400000000000000005000000000000000060000000000000000周圍組織10000000000000000200

11、0000000000000030000000000000000400000000000000005000000000000000060000000000000000上市品組血管100000000000000002000000000000000030000000000000000周圍組織100000000000000002000000000000000030000000000000000（右側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)，左側(cè)為生理鹽水） 圖1. 7th后48h兔耳照片（均為供試品組）注射7天結(jié)束后48h，試供品組取三只兔，左右耳各取1cm長(zhǎng)一段血管連同周圍組織行病理檢查；上市品組取兩只兔，左右耳各取1cm長(zhǎng)一段血

12、管連同周圍組織行病理檢查。其余兔繼續(xù)飼養(yǎng)14天后取血管連同周圍組織行病理檢查。觀察結(jié)果：供試品組：實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)組均顯示血管無(wú)充血，血管內(nèi)皮完整，無(wú)血栓形成，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周圍組織無(wú)明顯改變（圖2）；上市品組：實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)組均顯示血管無(wú)充血，血管內(nèi)皮完整，無(wú)血栓形成，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周圍組織無(wú)明顯改變（圖3）；換算成相應(yīng)的反應(yīng)級(jí)分值（見(jiàn)表3），供試品組與上市品累計(jì)得分均為0，無(wú)刺激性。1.5 結(jié)果判斷注射用鹽酸頭孢甲肟（批號(hào)100801）按臨床成人最大用藥劑量給藥，每日1次兔耳緣靜脈注射，每次5ml/kg ( 20mg/ml )，連續(xù)7天，肉眼及組織學(xué)檢查相較生理鹽水組均未見(jiàn)異常，

13、無(wú)刺激性。兩側(cè)對(duì)比無(wú)明顯差異。表明注射用鹽酸頭孢甲肟采用20mg/ml濃度靜脈注射對(duì)家兔耳緣靜脈無(wú)刺激作用。圖2 兔耳緣靜脈血管刺激試驗(yàn)組織學(xué)切片左為供試品，右為生理鹽水圖3 兔耳緣靜脈血管刺激試驗(yàn)組織學(xué)切片左為上市品，右為生理鹽水 表3 血管刺激試驗(yàn)病理觀察記分表分組兔號(hào)右（實(shí)驗(yàn)側(cè)）左（生理鹽水側(cè)）供試品組血管100200300400500600周圍組織100200300400500600上市品組血管100200300周圍組織1002003002注射用鹽酸頭孢甲肟對(duì)家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗(yàn)2.1 樣品準(zhǔn)備供試品為重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的注射用鹽酸頭孢甲肟（批號(hào)100801），對(duì)照上市品

14、為Takeda Phamaceutical Company Lmited, Hikan Plant.生產(chǎn)(批號(hào)：HK566；進(jìn)口藥品注冊(cè)號(hào)：H20090190)。供試品與上市品分別用0.9%氯化鈉注射液配制成20 mg/mL的溶液。陽(yáng)性對(duì)照品為高壓去離子水（實(shí)驗(yàn)室自備）。陰性對(duì)照品0.9%氯化鈉注射液，由西南藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào) 11111019）。2.2 動(dòng)物準(zhǔn)備日本大耳白兔，體重1.5-2kg，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2007-015，使用許可證號(hào)：SYXK（軍）2007-037。試驗(yàn)前于動(dòng)物房飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。2

15、.3 實(shí)驗(yàn)步驟2% 紅細(xì)胞混懸液的制備：固定家兔，心臟取兔血約8毫升，放入三角瓶中，用玻璃棒攪動(dòng)血液約10分鐘，以除去纖維蛋白、使成脫纖血液。加10倍的生理鹽水，搖勻，1500 rpm/min，離心10分鐘，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用生理鹽水如法洗滌6次，至上清液不顯紅色為止。取所得紅細(xì)胞1ml，用生理鹽水按體積比配成2%的懸液，紅細(xì)胞懸液50ml，供試驗(yàn)用。試驗(yàn)方法：取潔凈試管7支編號(hào)，15號(hào)為供試品管或上市品管，6管為陰性對(duì)照管，7管為陽(yáng)性對(duì)照管。按下表所示向各試管依次加入2% 紅細(xì)胞懸液、0.9% 氯化鈉注射液、供試品溶液或高壓去離子水，混勻后，放置于37±0.5恒溫箱中溫育

16、。開始時(shí)每隔15分鐘觀察一次，1小時(shí)后，每隔1小時(shí)觀察一次，觀察3小時(shí)，如溶液呈透明紅色，即表示溶血；如溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，表示有紅細(xì)胞凝聚作用。試管編號(hào)12345672%紅細(xì)胞混懸液（mL）2.52.52.52.52.52.52.50.9%氯化鈉注射液（mL）2.02.12.22.32.42.5供試品或上市品（mL）0.50.40.30.20.1高壓去離子水（mL）2.5觀察：完全溶血溶液澄明紅色，管底無(wú)細(xì)胞殘留。部分溶血溶液澄明紅色或棕色，管底有少量紅細(xì)胞殘留。無(wú) 溶 血紅細(xì)胞全部下沉，上層液體無(wú)色澄明。凝 聚雖不溶血，溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明有紅細(xì)胞凝聚。應(yīng)進(jìn)一步判斷是真凝聚還是假凝聚，凝聚物振搖后均勻分散，將凝聚物取出置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在蓋玻片邊緣滴2滴生理鹽水，在顯微鏡下觀察，凝聚的紅細(xì)胞能被沖散者為假凝聚。若凝聚物不被搖散或在玻片上不被沖散者為真凝聚。2.4 結(jié)果0、15、30、45、60、120、180 min后，供試品組及上市品組試管中紅細(xì)胞隨著時(shí)間增加而逐漸下沉，上層液體無(wú)色澄明，亦未見(jiàn)紅細(xì)胞凝集（左圖為試供品，右圖為上市品）。陰性對(duì)照管無(wú)溶血和凝聚發(fā)生，陽(yáng)性對(duì)照管溶液澄明紅色，管底無(wú)細(xì)胞殘留，為全溶血。 供試品 1h