生物制品生產(chǎn)和檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程(1)

1、生物制品生產(chǎn)和檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程本規(guī)程適用于人用生物制品生產(chǎn)/檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)，包括具有細(xì)胞庫體系的細(xì)胞及原代細(xì)胞。細(xì)胞基質(zhì)系指可用于生物制品生產(chǎn)/檢定的所有動物或人源的連續(xù)傳代細(xì)胞系、二倍體細(xì)胞株及原代細(xì)胞。 生產(chǎn)非重組制品所用的細(xì)胞基質(zhì)，系指來源于未經(jīng)修飾的用于制備其主細(xì)胞庫的細(xì)胞系/株和原代細(xì)胞。生產(chǎn)重組制品的細(xì)胞基質(zhì)，系指含所需序列的、從單個前體細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)，系指通過親本骨髓瘤細(xì)胞系與另一親本細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞系。一、對生產(chǎn)用細(xì)胞庫細(xì)胞基質(zhì)總的要求用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞系/株均須通過全面檢定，須具有如下相應(yīng)資料，并經(jīng)國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。（

2、一）細(xì)胞系/株歷史資料的要求1. 細(xì)胞系/株來源資料應(yīng)具有細(xì)胞系/株來源的相關(guān)資料，如細(xì)胞系/株制備機(jī)構(gòu)的名稱，細(xì)胞系/株來源的種屬、年齡、性別和健康狀況的資料。這些資料最好從細(xì)胞來源實(shí)驗(yàn)室獲得，也可引用正式發(fā)表文獻(xiàn)。人源細(xì)胞系/株須具有細(xì)胞系/株的組織或器官來源、種族及地域來源、年齡、性別及生理狀況的相關(guān)資料。動物來源的細(xì)胞系/株須具有動物種屬、種系、飼養(yǎng)條件、組織或器官來源、地域來源、年齡、性別、病原體檢測結(jié)果及供體的一般生理狀況的相關(guān)資料。 如采用已建株的細(xì)胞系/株，應(yīng)從具有一定資質(zhì)的細(xì)胞保藏中心獲取細(xì)胞，且應(yīng)提供該細(xì)胞在保藏中心的詳細(xì)傳代過程，包括培養(yǎng)過程中所使用的原材料的相關(guān)信息，具

3、有細(xì)胞來源的證明資料 。2細(xì)胞系/株培養(yǎng)歷史的資料應(yīng)具有細(xì)胞分離方法、細(xì)胞體外培養(yǎng)過程及建立細(xì)胞系/株過程的相關(guān)資料，包括所使用的物理、化學(xué)或生物學(xué)手段，是否有外源添加序列，以及細(xì)胞生長特征、生長液成分、選擇細(xì)胞所進(jìn)行的任何遺傳操作或選擇方法等。同時(shí)還應(yīng)具有細(xì)胞鑒別、檢定、內(nèi)源及外源因子檢查結(jié)果的相關(guān)資料。應(yīng)提供細(xì)胞培養(yǎng)液的詳細(xì)成分，如使用人或動物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物學(xué)活性的物質(zhì)，應(yīng)具有這些成分的來源、制備方法及質(zhì)量控制、檢測結(jié)果和質(zhì)量保證的相關(guān)資料。（二）細(xì)胞庫的建立細(xì)胞庫的建立可為生物制品的生產(chǎn)提供已標(biāo)定好的、細(xì)胞質(zhì)量相同的、能持續(xù)穩(wěn)定傳代的細(xì)胞種子。 1原材料的選

4、擇建立細(xì)胞庫的各種類型細(xì)胞的供體均應(yīng)符合本規(guī)程細(xì)胞的檢定中相關(guān)規(guī)定。神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞不得用于生物制品生產(chǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)液中不得使用人血清，如需使用人血白蛋白，則須使用有批準(zhǔn)文號的合格制品。消化細(xì)胞用胰蛋白酶應(yīng)進(jìn)行檢測，證明其無細(xì)菌、真菌、支原體或病毒污染。特別應(yīng)檢測胰蛋白酶來源的動物可能攜帶的病毒，如細(xì)小病毒等。用于生物制品生產(chǎn)的培養(yǎng)物中不得使用青霉素或-內(nèi)酰胺(-Lactam)類抗生素。配制各種溶液的化學(xué)藥品應(yīng)符合中國藥典（二部）或其他相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。2細(xì)胞操作的環(huán)境要求細(xì)胞培養(yǎng)的操作應(yīng)符合中國藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的要求。生產(chǎn)人員應(yīng)定期檢查身體。在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得進(jìn)行非生產(chǎn)制品用細(xì)胞或微生物的

5、操作；在同一工作日進(jìn)行細(xì)胞操作前，不得操作或接觸有感染性的微生物或動物。3建立細(xì)胞庫細(xì)胞庫為三級管理，即原始細(xì)胞庫、主細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫。如為引進(jìn)的細(xì)胞，可采用 主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫組成的二級細(xì)胞庫管理。在某些特殊情況下，也可使用MCB一級庫，但須得到國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門的批準(zhǔn)。（1）原始細(xì)胞庫(PCB)由一個原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體，或經(jīng)過克隆培養(yǎng)而形成的均一細(xì)胞群體，通過檢定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢定。在特定條件下，將一定數(shù)量、成分均一的細(xì)胞懸液，定量均勻分裝于安瓿，于液氮或-130以下凍存，即為原始細(xì)胞庫，供建立主細(xì)胞庫用。（2）主細(xì)胞庫(MCB)取原始細(xì)胞庫細(xì)胞，通過一

6、定方式進(jìn)行傳代、增殖后均勻混合成一批，定量分裝，保存于液氮或-130以下。這些細(xì)胞必須按其特定的質(zhì)控要求進(jìn)行全面檢定，應(yīng)合格。主細(xì)胞庫用于工作細(xì)胞的制備，每個生產(chǎn)企業(yè)的主細(xì)胞庫最多不得超過兩個細(xì)胞代次。（3）工作細(xì)胞庫(WCB)工作細(xì)胞庫的細(xì)胞由MCB細(xì)胞傳代擴(kuò)增制成。由MCB的細(xì)胞經(jīng)傳代增殖， 達(dá)到一定代次水平的細(xì)胞，合并后制成一批均質(zhì)細(xì)胞懸液，定量分裝于安瓿或適宜的細(xì)胞凍存管，保存于液氮或-130以下備用，即為工作細(xì)胞庫。每個生產(chǎn)企業(yè)的工作細(xì)胞庫必須限定為一個細(xì)胞代次。凍存時(shí)細(xì)胞的傳代水平須確保細(xì)胞復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞數(shù)量能滿足生產(chǎn)一批或一個亞批制品。 復(fù)蘇后細(xì)胞的傳代的水平應(yīng)不超過批準(zhǔn)的

7、該細(xì)胞用于生產(chǎn)限制最高限定代次。所制備的WCB必須經(jīng)檢定合格（見本規(guī)程細(xì)胞檢定中有關(guān)規(guī)定）后，方可用于生產(chǎn)。4細(xì)胞庫的管理每種細(xì)胞庫均應(yīng)分別建立臺帳，記錄放置位置、容器編號、分裝及凍存數(shù)量，取用記錄等。細(xì)胞庫中的每支細(xì)胞安瓿或細(xì)胞凍存管均應(yīng)注明細(xì)胞系/株名、代次、批號、編號、凍存日期，儲存容器的編號等。凍存前細(xì)胞活力應(yīng)在90%以上，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率應(yīng)不低于85%。凍存后的細(xì)胞，應(yīng)至少作一次復(fù)蘇培養(yǎng)并連續(xù)傳代至衰老期，檢查不同傳代水平的細(xì)胞生長情況。主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫分別存放。非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開存放。（三）細(xì)胞檢定細(xì)胞檢定主要包括以下幾個方面：細(xì)胞鑒別、外源因子和內(nèi)源因子的檢查

8、、致瘤性檢查等。必要時(shí)還須進(jìn)行細(xì)胞染色體核型檢查。這些檢測內(nèi)容對于MCB細(xì)胞和WCB細(xì)胞及生產(chǎn)限定代次細(xì)胞均適用。細(xì)胞檢定的基本要求見下表1。細(xì)胞庫建立后應(yīng)至少對MCB細(xì)胞及生產(chǎn)終末細(xì)胞進(jìn)行一次全面檢定。每次從MCB建立一個新的WCB，均應(yīng)按規(guī)定項(xiàng)目進(jìn)行檢定。 表1、 細(xì)胞檢定項(xiàng)目要求檢測項(xiàng)目 MCBWCB生產(chǎn)終末細(xì)胞*細(xì)胞鑒別+無菌檢查+支原體檢查+病毒污染檢查：外源病毒體外培養(yǎng)法+體內(nèi)接種法+-+種屬特異性病毒+-+逆轉(zhuǎn)錄病毒+-+細(xì)胞致瘤性+-+ *生產(chǎn)終末細(xì)胞:是指按生產(chǎn)規(guī)模制備的終末代次細(xì)胞。1細(xì)胞鑒別試驗(yàn)新建細(xì)胞系/株、細(xì)胞庫(MCB和WCB)和生產(chǎn)終末細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，以確認(rèn)為

9、本細(xì)胞，無其他細(xì)胞的交叉污染。細(xì)胞鑒別試驗(yàn)方法有多種，包括細(xì)胞形態(tài)、生物化學(xué)法(如同工酶試驗(yàn))、免疫學(xué)檢測(如HLA、種特異性抗血清)、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(如染色體核型、標(biāo)記染色體檢測)、遺傳標(biāo)志檢測(如DNA指紋圖譜、STR圖譜、基因組二核苷重復(fù)序列 )等?？蛇x其中一種或幾種方法，但均須經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可。細(xì)胞表型特征與遺傳學(xué)特征相結(jié)合來判斷，更有利于細(xì)胞鑒別。2無菌檢查取混合細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄XII A）。 3支原體檢查取細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄XII B進(jìn)行），應(yīng)為陰性。4細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查應(yīng)注意檢查細(xì)胞系/株中是否有來源物種中

10、潛在的可傳染的病毒，以及由于操作帶入的外源性病毒。細(xì)胞進(jìn)行病毒檢查的種類及方法，須根據(jù)細(xì)胞的種屬來源、組織來源及細(xì)胞特性決定。（1）細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)取混合瓶細(xì)胞樣品，接種至少6個細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長成單層后換維持液，持續(xù)培養(yǎng)兩周。如有必要,可以適當(dāng)換液。每日鏡檢細(xì)胞，細(xì)胞應(yīng)保持正常形態(tài)特征。如為貼壁細(xì)胞或半貼壁細(xì)胞， 細(xì)胞至少培養(yǎng)14天后，分別取1/3細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，用0.2%0.5% 豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行血吸附試驗(yàn)。加入紅細(xì)胞后置28 30分鐘，然后置2025 30分鐘，分別進(jìn)行鏡檢，觀察紅細(xì)胞吸附情況，結(jié)果應(yīng)紅細(xì)胞吸附應(yīng)為陰性。 新鮮紅細(xì)胞在28保存不得超過

11、7天, 且溶液中不應(yīng)含有鈣或鎂離子。（2）不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子將待檢細(xì)胞分別接種下列三種單層細(xì)胞，包括猴源細(xì)胞、人源二倍體細(xì)胞和同種屬同組織類型來源的細(xì)胞。每種單層細(xì)胞接種至少107個含有原細(xì)胞培養(yǎng)上清液的活細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解物，每種細(xì)胞至少接種2瓶。接種供試品量應(yīng)占維持液的1/4以上，培養(yǎng)至少14天。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)立病毒陽性對照，包括可觀察細(xì)胞病變的病毒陽性對照、血凝陽性對照及血吸附陽性對照。如細(xì)胞裂解物對單層細(xì)胞有干擾，則應(yīng)排除干擾因素。在培養(yǎng)第7天時(shí)，分別取每種接種的單層細(xì)胞上清液各一瓶，分別接種于新鮮制備的相應(yīng)的單層細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)7天，觀察細(xì)胞病變并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)。

12、每種接種的單層細(xì)胞不得出現(xiàn)細(xì)胞病變，血吸附試驗(yàn)應(yīng)均為陰性。若待檢細(xì)胞已知可支持人巨細(xì)胞病毒(CMV)的生長，則應(yīng)在接種人二倍體細(xì)胞后至少觀察28天，應(yīng)無細(xì)胞病變。同時(shí)，應(yīng)進(jìn)行血吸附試驗(yàn),應(yīng)為陰性。（3）接種動物和雞胚法檢測病毒因子MCB或WCB細(xì)胞、增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞須采用動物體內(nèi)接種法進(jìn)行外源病毒因子檢測。選用乳鼠、成鼠和雞胚(兩組不同日齡)共計(jì)4組， 按表2所列方法進(jìn)行試驗(yàn)和觀察。接種細(xì)胞后，任何動物出現(xiàn)異?；蚣膊【鶓?yīng)進(jìn)行原因分析。觀察到期時(shí)，應(yīng)至少有80%以上接種動物或雞胚健存，視為試驗(yàn)有效。接種動物未顯示有外源病毒感染，則細(xì)胞判定為合格。表 2 動物體內(nèi)接種法檢

13、測外源病毒因子動物組要求數(shù)量接種途徑細(xì)胞濃度 (個活細(xì)胞/ml)接種細(xì)胞液量(ml/只)觀察天數(shù)結(jié) 果 判 定乳鼠24小時(shí)內(nèi)10(2窩)腦內(nèi)腹腔1x1070.010.121應(yīng)健存成鼠1520g10腦內(nèi)腹腔1x 1070.030.521應(yīng)健存雞胚*911日齡10尿囊腔1x 1070.234尿液血凝試驗(yàn)陰性雞胚56日齡10卵黃囊1x 1070.55應(yīng)存活豚鼠350500g5腹腔1x 1075.042應(yīng)健存，解剖無結(jié)核病變家兔1.52.5kg5皮下皮內(nèi)*1x 1079.00.1X1021無異常，健存* 經(jīng)尿囊腔接種的雞胚，在觀察末期，應(yīng)用豚鼠和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行直接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。 *每只家兔于皮

14、內(nèi)注射10處 每處0.1ml對于新建細(xì)胞系/株，還應(yīng)接種豚鼠和家兔（見表1）。豚鼠主要用于檢查細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分支桿菌，在注射前觀察4周，結(jié)核菌素試驗(yàn)為陰性者方可用于試驗(yàn)。家兔主要用于檢測猴來源細(xì)胞中是否存在B病毒污染，也可用兔腎細(xì)胞培養(yǎng)法代替。（4）逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測可采用下列方法對MCB或WCB細(xì)胞、增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測。逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定：采用敏感的方法,如產(chǎn)品增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法(PERT)法或其他靈敏度相當(dāng)?shù)臋z測逆轉(zhuǎn)錄酶的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中逆轉(zhuǎn)錄酶活性。透射電鏡檢查：收集待檢細(xì)胞，低速離心后，棄上清，沉淀中應(yīng)含有1&

15、#215;107個細(xì)胞，且細(xì)胞存活率應(yīng)不低于99%。在沉淀中加入固定劑，于4保存或直接包埋后制備超薄切片，置于銅網(wǎng)上染色后透射電鏡觀察。感染性試驗(yàn)：將待檢細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后檢測。根據(jù)待檢細(xì)胞的種屬來源，須使用不同的敏感細(xì)胞進(jìn)行感染性試驗(yàn)。這三種方法具有不同的檢測特性及靈敏度，因此應(yīng)采用不同的方法聯(lián)合檢測。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測陽性時(shí)，建議進(jìn)行透射電鏡檢查及感染性試驗(yàn)，以確證是否有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒存在。小鼠來源和其他嚙齒類來源的細(xì)胞系或其雜交瘤細(xì)胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒。因此，對于人-鼠雜交瘤細(xì)胞系則應(yīng)進(jìn)行特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測。如用于單克隆抗體生產(chǎn)的小鼠細(xì)胞系，則可不檢測特

16、異性的逆轉(zhuǎn)錄病毒，但在生產(chǎn)工藝中應(yīng)增加病毒滅活程序。（5） 特殊外源病毒因子的檢測應(yīng)對MCB或WCB的細(xì)胞進(jìn)行特殊病毒的檢測。檢測病毒的種類應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系/株種屬、組織來源等確定。如鼠源的細(xì)胞系，可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)檢測其種特異病毒。人源的細(xì)胞系/株，則應(yīng)檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細(xì)胞病毒、人逆轉(zhuǎn)錄病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情況下，也可能進(jìn)行轉(zhuǎn)化病毒的檢測，如人乳頭瘤病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒。這些病毒的檢測可采用適當(dāng)?shù)捏w外檢測技術(shù)。5致瘤性檢查某些傳代細(xì)胞系已證明具有致瘤性，如來源于嚙齒類的細(xì)胞系BHK21，CHO，C127細(xì)胞等，或細(xì)胞類型屬致瘤性細(xì)胞，如雜交

17、瘤細(xì)胞，則可不必作致瘤性檢查。某些傳代細(xì)胞系已證明在一定代次內(nèi)不具有致癌性，而超過某代次則具有致瘤性，如VERO細(xì)胞，則必須進(jìn)行致瘤性檢查。人上皮細(xì)胞系、人二倍體細(xì)胞株及所有用于活病毒疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系/株應(yīng)進(jìn)行致瘤性檢查。另外，新建細(xì)胞系/ 株必須進(jìn)行致瘤性檢查。在某些情況下，用于人體細(xì)胞治療及基因治療的細(xì)胞也須進(jìn)行致瘤性檢查。將MCB或WCB的細(xì)胞增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次，再進(jìn)行致瘤性試驗(yàn)?！毕率鰞煞N致癌性試驗(yàn)方法可任選其一：裸鼠 至少10只，將細(xì)胞懸浮于適量無血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞濃度為5×107個細(xì)胞/ml，每只裸鼠皮下或肌內(nèi)注射0.2ml；同時(shí)用Hela或Hep-2

18、細(xì)胞設(shè)立陽性對照，陽性對照組至少10只，每只注射0.2ml含106個細(xì)胞；可用人二倍體細(xì)胞株作為陰性對照，陰性對照組至少10只，每只注射0.2ml含1067個細(xì)胞。新生小鼠(35日齡)，810g小鼠10只，在出生后第0天、2天、7天和第14天，分別用0.1ml抗胸腺血清(ATS)或球蛋白處理，然后同上每只皮下接種107活細(xì)胞。并設(shè)立陽性對照組，對照組至少接種10只。 結(jié)果判定： 定期觀察并觸摸注射部位有無結(jié)節(jié)形成，且形成的任何結(jié)節(jié)均應(yīng)進(jìn)行雙向測量并記錄。 陽性對照組應(yīng)至少有9只有進(jìn)行性腫瘤生長時(shí)，試驗(yàn)視為有效。 如試驗(yàn)組動物有進(jìn)行性生長的結(jié)節(jié)或可疑病灶，應(yīng)觀察至少12周；若出現(xiàn)的結(jié)節(jié)在觀察期內(nèi)

19、開始消退，則應(yīng)在結(jié)節(jié)完全消退前，處死動物并進(jìn)行解剖作病理及組織學(xué)檢查。未發(fā)生結(jié)節(jié)的動物半數(shù)應(yīng)觀察21天，剖檢，另外半數(shù)動物應(yīng)觀察12周，進(jìn)行病理檢查，剖檢接種部位，觀察各淋巴結(jié)和各器官有無結(jié)節(jié)形成，如有懷疑，進(jìn)行病理組織檢查，不應(yīng)有轉(zhuǎn)移瘤形成。除上述體內(nèi)法外，也可采用軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)或器官培養(yǎng)試驗(yàn)等體外法檢測，特別適用于在低代次時(shí)在動物體內(nèi)無致瘤性的傳代細(xì)胞系。（四）生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)用原材料的選擇和細(xì)胞操作環(huán)境應(yīng)符合本規(guī)程細(xì)胞庫的建立中有關(guān)規(guī)定。從凍存的WCB中取出一支或多支安瓿，混合后培養(yǎng)，傳至一定代次后供生產(chǎn)用。其代次不得超過該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。生產(chǎn)用細(xì)胞的最高限定代次應(yīng)根據(jù)

20、研究結(jié)果確定，但不得超過國際認(rèn)可的最高限定代次。從WCB取出的細(xì)胞種子增殖的細(xì)胞不得再回凍保存后而再用于生產(chǎn)。體外培養(yǎng)細(xì)胞齡的計(jì)算 二倍體細(xì)胞齡以細(xì)胞群體倍增（Population Doubling）計(jì)算，以每個培養(yǎng)容器細(xì)胞群體細(xì)胞數(shù)為基礎(chǔ)，每增加一倍作為一世代，即一瓶細(xì)胞傳二瓶(1:2分種率)，再長滿瓶為一世代；一瓶傳四瓶(1:4)為二世代；一瓶傳八瓶(1:8)則為三世代。生產(chǎn)用細(xì)胞齡限制在細(xì)胞壽命期限的前2/3內(nèi)。傳代細(xì)胞系則以一定稀釋倍數(shù)進(jìn)行傳代，每傳一次為一代。二、連續(xù)傳代細(xì)胞系的特殊要求傳代細(xì)胞系一般是由人或動物腫瘤組織或正常組織傳代或轉(zhuǎn)化而來，可懸浮培養(yǎng)或采用載體培養(yǎng)，能大規(guī)模生產(chǎn)

21、。這些細(xì)胞可無限傳代，但到一定代次后，致瘤性會增強(qiáng)。所以對生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格檢查。應(yīng)按本規(guī)程細(xì)胞的檢定的規(guī)定進(jìn)行細(xì)胞庫的檢查。對生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的要求如下：1用于生產(chǎn)的細(xì)胞代次用于生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，生產(chǎn)代次應(yīng)有一定限制。用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞最高限定代次，須經(jīng)批準(zhǔn)。2生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)物檢查：對于病毒類制品，在生產(chǎn)末期，應(yīng)按照本規(guī)程中的三.6（2）、（3）、（4）和（5）對生產(chǎn)對照用細(xì)胞進(jìn)行檢查，并合格。對于在不同時(shí)間收集合并的培養(yǎng)物，應(yīng)在每次收集時(shí)檢測對照細(xì)胞培養(yǎng)物。三、人二倍體細(xì)胞株的特殊要求新建的人二倍體細(xì)胞必須具有以下資料：建立細(xì)胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的原因、所用

22、胎兒父母的年齡、職業(yè)及健康良好的證明（醫(yī)師出具的健康狀態(tài)良好、無潛在性傳染病和遺傳性疾患等證明），以及胎兒父系及母系三代應(yīng)無明顯遺傳缺陷疾病歷史的書面調(diào)查資料。人二倍體細(xì)胞株應(yīng)在傳代過程的早期，選擇適當(dāng)世代水平（2-8世代）增殖出大量細(xì)胞，定量分裝后，置液氮中或130下凍存，供建立PCB之用，待全部檢定合格后，即可正式定為PCB，供制備MCB用。1染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)新建人二倍體細(xì)胞株及其細(xì)胞庫必須進(jìn)行染色體檢查。對于已建株的人二倍體細(xì)胞株，如WI-38、MRC-5、2BS，KMB17等，在建立MCB時(shí)可不必進(jìn)行細(xì)胞染色體檢查。但如對細(xì)胞進(jìn)行了遺傳修飾，則須按新建細(xì)胞株進(jìn)行染色體檢查。（1）染

23、色體檢查新細(xì)胞建株過程中，每812世代應(yīng)作一次染色體檢查，一株細(xì)胞整個生命期內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)過程中，至少應(yīng)有4次染色體檢查結(jié)果。每次染色體檢查，應(yīng)至少隨機(jī)取1000個分裂中期細(xì)胞，進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)檢查，并作記錄以備復(fù)查。其中至少選擇50個分裂中期細(xì)胞進(jìn)行顯微照相，作出核型分析，并應(yīng)粗?jǐn)?shù)500個分裂中期細(xì)胞，檢查多倍體的發(fā)生率。每次染色體檢查，應(yīng)從同一世代的不同培養(yǎng)瓶中取細(xì)胞，混合后進(jìn)行再培養(yǎng)，制備染色體標(biāo)本片。染色體片應(yīng)長期保存，以備復(fù)查?？捎肎分帶或Q分帶技術(shù)檢查50個中期細(xì)胞染色體帶型，應(yīng)用照相圖片作出帶型分析。（2）判定標(biāo)準(zhǔn)對1000個和500個中期細(xì)胞標(biāo)本異常率進(jìn)行檢查，合格的上限

24、(可信限90% Poison法)如表2。表2 人二倍體細(xì)胞染色體分析標(biāo)準(zhǔn)檢查細(xì)胞數(shù)異 常1000500100染色單體和染色體斷裂47268結(jié)構(gòu)異常17102超二倍體852亞二倍體*1809018多倍體*30174* 亞二倍體如超過上限，可能因制片過程人為地丟失染色體，應(yīng)選同批號標(biāo)本重新計(jì)數(shù)。* 一個中期細(xì)胞內(nèi)超過53條染色體即為一個多倍體。2 無菌檢查每812世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行無菌檢查， 依法檢查， 應(yīng)符合規(guī)定（附錄XII A）。3 支原體檢查每812世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行支原體檢查，依法檢查， 應(yīng)符合規(guī)定（附錄XII B）。4 病毒檢查二倍體細(xì)胞株傳代過程中，至少對2個不同世代水平進(jìn)行病

25、毒包含體、乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒，艾滋病病毒進(jìn)行檢查等，結(jié)果應(yīng)均為陰性。5 致瘤性檢查每812世代應(yīng)作一次致瘤性檢查，（方法見本規(guī)程 致瘤性檢查），結(jié)果應(yīng)無致癌性。6生產(chǎn)過程細(xì)胞培養(yǎng)檢查（1）染色體檢查可根據(jù)制品特性及生產(chǎn)工藝，確定是否進(jìn)行生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的染色體檢查。 通常含有活細(xì)胞的制品或下游純化工藝不足的制品，應(yīng)對所用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行染色體檢查及評價(jià)。（見本規(guī)程 “染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)”）但如采用已建株的人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)，則不要求進(jìn)行染色體核型檢查。（2）細(xì)胞鑒別試驗(yàn)按本規(guī)程“ 細(xì)胞檢定”中細(xì)胞鑒別試驗(yàn)進(jìn)行。對于每個制品生產(chǎn)用細(xì)胞每年應(yīng)至少進(jìn)行一次該項(xiàng)檢定。（3）無菌檢查依法檢查，應(yīng)

26、符合規(guī)定（附錄XII A）。（4） 支原體檢查依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定（附錄XII B）。（5） 正常細(xì)胞外源病毒因子檢測制備病毒類制品時(shí)，于接種病毒的當(dāng)天或在連續(xù)傳代的最后一次接種病毒時(shí)，留取此批細(xì)胞的5%(或不少于500ml)的細(xì)胞不接種病毒，換維持液作為正常細(xì)胞對照。與接種病毒的細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)，并按附錄C生產(chǎn)用細(xì)胞外源因子檢查項(xiàng)進(jìn)行檢測。四、重組細(xì)胞的特殊要求重組細(xì)胞系通過DNA重組技術(shù)獲得的含有特定基因序列的細(xì)胞系，因此重組細(xì)胞系的建立應(yīng)具有細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建方法的相關(guān)資料，如細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染、篩選、集落分離、克隆、基因擴(kuò)增及培養(yǎng)條件或培養(yǎng)液的適應(yīng)性等方面的資料。細(xì)胞庫細(xì)胞的檢查應(yīng)按本規(guī)程細(xì)

27、胞的檢定的規(guī)定進(jìn)行，但還應(yīng)進(jìn)行下述檢查：1 細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性生產(chǎn)者須具有該細(xì)胞用于生產(chǎn)的目的基因的穩(wěn)定性資料，包括：重組細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性、目的產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性，以及一定條件下保存時(shí)細(xì)胞生產(chǎn)目的產(chǎn)品能力的穩(wěn)定性等資料。2 鑒別試驗(yàn)除按本規(guī)程“細(xì)胞鑒別試驗(yàn)”進(jìn)行外，還應(yīng)通過檢測目的蛋白基因或蛋白進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。3 重組細(xì)胞產(chǎn)物的外源病毒因子檢測應(yīng)按本規(guī)程“細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)”和“不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢病毒因子”的要求對細(xì)胞裂解物或收獲液及生產(chǎn)用培養(yǎng)基進(jìn)行外源病毒因子的檢測。五、原代細(xì)胞的要求原代細(xì)胞應(yīng)來源于健康的動物臟器組織或胚胎，包括猴腎、地鼠腎、沙鼠腎、家兔腎、狗

28、腎或動物的胎兒和其他組織以及雞胚和鵪鶉胚等正常組織，以適當(dāng)?shù)南合?、分散組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，原代細(xì)胞不能建立細(xì)胞庫，只能限于原始培養(yǎng)的細(xì)胞或傳代少數(shù)幾代內(nèi)（一般1-5代內(nèi)）使用，無法事先標(biāo)定。因此，只能嚴(yán)格規(guī)范管理和操作措施，以保證以原代細(xì)胞為基質(zhì)所生產(chǎn)的制品質(zhì)量。（一）動物組織來源和其他材料1動物組織來源應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。對各種動物都應(yīng)有明確健康狀況和潔凈級別要求。2生產(chǎn)或檢定用猴多采用非洲綠猴、恒河猴等，我國以恒河猴為主。應(yīng)為正常健康猴，以籠養(yǎng)或小群混養(yǎng)。動物用于制備細(xì)胞前，應(yīng)有6周以上的檢疫期，檢疫期中出現(xiàn)病猴或混入新猴，應(yīng)重新檢疫。從外面新引入猴群應(yīng)作結(jié)核菌素試驗(yàn)及猴皰疹I(lǐng)型

29、病毒(B病毒)的檢查。胎猴腎可用于生產(chǎn)，對其母猴應(yīng)進(jìn)行檢疫。（二）原代細(xì)胞培養(yǎng)物的檢查用于細(xì)胞制備的動物剖檢應(yīng)正常，取留的器官組織亦應(yīng)正常，如有異常，不能用于制備細(xì)胞。1細(xì)胞培養(yǎng)原材料檢查及細(xì)胞培養(yǎng)操作按本規(guī)程 “原材料的選擇”及“細(xì)胞培養(yǎng)操作的環(huán)境要求”進(jìn)行。2 細(xì)胞培養(yǎng)物的檢查（1） 細(xì)胞形態(tài)檢查細(xì)胞在接種病毒或用于生產(chǎn)前，其培養(yǎng)物均應(yīng)進(jìn)行外觀檢查和鏡檢，應(yīng)無任何可疑、異常和病變，否則不得用于生產(chǎn)。（2） 對照細(xì)胞檢查每批消化所得原代細(xì)胞留取5% (或至少500ml)懸液，不接種病毒，細(xì)胞濃度和處理均與生產(chǎn)制品過程相同，至少觀察14天，并作下列各項(xiàng)檢查，結(jié)果均應(yīng)為陰性。無菌檢查 依法檢查，

30、應(yīng)符合規(guī)定（附錄XII A）。支原體檢查依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定（附錄XII B）。外源病毒污染的檢查 對觀察到期的細(xì)胞，按本規(guī)程4（1）項(xiàng)“細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)”和4（2）項(xiàng)“不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子”項(xiàng)進(jìn)行外源病毒污染檢測。原代細(xì)胞培養(yǎng)物特定病毒檢查原代猴腎細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)檢查SV40病毒、猴艾滋病毒和B病毒。應(yīng)用Vero或原代綠猴腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞檢查。地鼠腎原代細(xì)胞應(yīng)用BHK21細(xì)胞培養(yǎng)檢查，觀察細(xì)胞形態(tài)，如有可疑應(yīng)在同種細(xì)胞上盲傳一代繼續(xù)觀察。六、檢定用細(xì)胞的要求檢定用細(xì)胞是指生物制品制造過程中用于檢定的細(xì)胞，包括原代細(xì)胞、連續(xù)傳代細(xì)胞或二倍體細(xì)胞，以及經(jīng)特定基因修飾過的細(xì)胞。檢定用細(xì)

31、胞的質(zhì)量對檢定結(jié)果的判定具有重要的影響，因此，為保證檢定結(jié)果的有效性、可靠性及真實(shí)性，國家藥品檢定檢定機(jī)構(gòu)和生物制品生產(chǎn)企業(yè)檢定部門所用的檢定用細(xì)胞應(yīng)符合下列要求：（一）細(xì)胞資料1、 檢定用細(xì)胞應(yīng)具有明確的合法來源，及相關(guān)的來源證明資料。 2、 如使用傳代細(xì)胞系/株，應(yīng)建立細(xì)胞庫體系，即主細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫，如細(xì)胞使用量較少，可建立單一細(xì)胞庫。各制品應(yīng)根據(jù)其特性以及保證檢測結(jié)果的可靠性基礎(chǔ)上，在該細(xì)胞允許的最高限定代次內(nèi)，規(guī)定相應(yīng)檢定用細(xì)胞的代次范圍（應(yīng)在確定細(xì)胞代次的±1代范圍內(nèi)）。檢定時(shí)從工作細(xì)胞庫復(fù)蘇細(xì)胞后，不能再回凍。3、 應(yīng)詳細(xì)記錄檢定用細(xì)胞建庫的過程，包括細(xì)胞培養(yǎng)所用原材

32、料的來源、批號，細(xì)胞生長液的配制方法、使用濃度等，記錄細(xì)胞的傳代及凍存過程，并建立細(xì)胞凍存及使用臺賬。（二）細(xì)胞檢定生物制品檢定用細(xì)胞應(yīng)至少進(jìn)行以下1-3項(xiàng)檢定， 根據(jù)檢定用細(xì)胞用途的不同， 還應(yīng)按照4項(xiàng)下的有關(guān)要求進(jìn)行相關(guān)的檢定。1、細(xì)胞鑒別試驗(yàn)按本規(guī)程一（三）1項(xiàng)進(jìn)行，或其他相適應(yīng)的方法，應(yīng)確認(rèn)為本細(xì)胞而無其他細(xì)胞的交叉污染。2、無菌檢查依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄XII A）。3、支原體檢測依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄XII B）。4. 外源病毒污染檢查用于待檢樣品外源病毒污染檢查所用的細(xì)胞，應(yīng)采用本規(guī)程一（三）4（2）項(xiàng)及4（3）項(xiàng)雞胚接種檢查，應(yīng)無外源病毒污染。5、其他檢測：（1）致

33、瘤性檢查：對于待檢樣品致瘤性檢查時(shí)所用的陽性對照細(xì)胞，應(yīng)采用本規(guī)程一（三）5項(xiàng)進(jìn)行檢查，應(yīng)具有致瘤性。（2）病毒敏感性檢查：用于活病毒類待檢樣品病毒效價(jià)測定的檢定用細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)行此項(xiàng)檢查，證明所用細(xì)胞具有足夠的相應(yīng)病毒敏感性。（3）細(xì)胞功能檢查：用于待檢樣品生物學(xué)活性、效力或效價(jià)測定的檢定用細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)行此項(xiàng)檢查，證明所用細(xì)胞能夠有效評價(jià)待檢樣品質(zhì)量。附錄逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢查法附錄IX M 逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢查法 本法系以雀麥草花葉病毒RNA為模板，采用RT-PCR法擴(kuò)增特定片段并用ELISA法檢測特異片段與探針的雜交信號，從而測定供試品中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。 試劑 (1)供試品稀釋液(A液) 每1L A液含

34、三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl,pH7.5）25mmol,氯化鉀50mmol, 二硫蘇糖醇(DTT) 5mmol,四甲基乙二胺（EDTA）0.25mmol, TritonX-100 25ml,甘油500ml。(2)供試品保存液(液) 每1L A液中含1mg亮抑蛋白酶肽、0.7mg抑胃肽及1mg抑蛋白酶肽。(3)引物及探針序列 上游引物：5-Biotin-CGTGGTTGACACGCAGACCTCTTAC-3下游引物：5-TCAACACTGTACGGCACCCGCATTC-3探 針：5-NH2ATTATCTGGCCTTTGAGAGTTACTCTTTG-3(4)模板 雀麥草花葉病毒RNA(

35、BMV RNA)(5)反轉(zhuǎn)錄緩沖液 每1L反轉(zhuǎn)錄緩沖液含Tris-HCl(pH8.3) 50mmol, 氯化鉀40mmol, 氯化鎂6mmol, DTT 10mmol，脫氧核糖核苷酸200mol,下游引物0.8×103 mmol。 (6)擴(kuò)增緩沖液 每1L擴(kuò)增緩沖液含Tris-HCl(pH8.8) 25mmol, 氯化鉀40mmol,氯化鎂2mmol,脫氧腺嘌呤核糖核苷酸200mol、脫氧胞嘧啶核糖核苷酸200mol、脫氧鳥嘌呤核糖核苷酸200mol及脫氧尿嘧啶核糖核苷酸200mol,上、下游引物各0.4×103 mmol，核糖核酸酶A 0.8g， Taq DNA聚合酶6×10