免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理

1、免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。 免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的抗體有哪些？ 免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。 免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？ 實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍

2、切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。 其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。 石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？ 石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。 免疫組化常用的染色方法有哪些？ 根

3、據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用。 抗體交叉反應(yīng)的原因： 指抗體除與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外還與其它抗原發(fā)生反應(yīng)。產(chǎn)生的原因有以下幾個方面： 1. 抗原特異性指用于免疫動物的抗原性物質(zhì)中含有多種抗原分子，它引起動物產(chǎn)生針對多種抗原分子特異性的相應(yīng)抗體。任何其它物質(zhì)只要含有一種或多種與上述物質(zhì)相同的抗原分子，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)。 2. 共同決定簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。 3

4、. 決定簇相似，兩種不同的抗原決定簇，如果結(jié)構(gòu)大致相同，由于空間構(gòu)象關(guān)系，某一決定簇的相應(yīng)抗體可以與大致相同的決定簇發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然抗原一抗體之間構(gòu)象相似時的結(jié)合力小于吻合時的結(jié)合力。 歡迎常到免疫版討論區(qū)做客 我為人人，人人為我免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 一、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的概述 *免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry, ICC） -是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定細(xì)胞內(nèi)抗原的成分（主要是多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為。 （一） 對抗原和抗體的要求 *具有特異性高和親和力強(qiáng)的抗體是實(shí)

5、驗(yàn)成功的首要條件。 -對抗體的要求：純度高、比活性強(qiáng)； *高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。 -對抗原的要求：純度高，免疫原性強(qiáng)，穩(wěn)定無變化。 （二） 抗原 （antigen, Ag） *抗原的概念：凡是在機(jī)體內(nèi)引起體液免疫和（或）細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱為抗原?？乖哂袃蓚€方面的特性： -免疫原性：引起機(jī)體產(chǎn)生抗體和（或）致敏淋細(xì)胞的特性； -免疫反應(yīng)性：抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性。 *根據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為： -完全抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成。 *免疫原性最強(qiáng)的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖

6、形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。 -半抗原：又稱為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。 *半抗原必需與載體結(jié)合，才能獲得免疫原性。 載 體 *通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。 -常用的載體有鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。 -用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過功能基團(tuán)-NH2、-COOH等將半抗原結(jié)合到載體上。結(jié)合比例為5kDa結(jié)合525個分子的小肽。 （三）抗體 （antib

7、ody, Ab） 1、抗體的概念： *機(jī)體受到抗原刺激后，由漿細(xì)胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，被稱為抗體。 -抗體主要存在于血清內(nèi)； -抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。 -免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。 2、免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體：單克隆抗體和多克隆抗體。 *單克隆抗體：是一個B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，是應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備的。 -特異性強(qiáng)、抗體產(chǎn)量高。 *多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。 -特

8、異性低，會產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)。 -多克隆抗體廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機(jī)會。 -抗原與抗體的結(jié)合，要求量保持一定比例，當(dāng)抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。 3、抗體的制備多克隆抗體的制備 *動物的選擇 *佐劑（adjuvant） *免疫方法 *免疫劑量 *抗體效價的測定 *放血或定期抽血 （1） 動物的選擇 選擇什么動物來免疫取決于： *所需抗血清的量 -小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供幾升。 *能供免疫用的抗原量 -小鼠50?g足夠，而山羊需要幾毫克。 （1） 動物的選擇（續(xù)） *動物的品系：免疫動物與提供抗原的動物之間的種系差異越大越好。 -例如哺乳動

9、物的抗原可選擇非哺乳動物來制備抗體。 -常用的動物有兔、羊、馬、豬等，以兔（新西蘭兔，年輕，健壯，體重在2.5kg左右，雄性）為最常用。 （2） 佐劑 （adjuvant） *一般可溶性抗原注射后，迅速從注射部位擴(kuò)散、吸收代謝。佐劑可延長潴留時間，且延長免疫刺激作用。因此在制備抗體的過程中，常將抗原和佐劑一起注射。 *最常用的佐劑是弗氏佐劑，又分為: -弗氏不完全佐劑（Freunds incomplete adjuvant） -弗氏完全佐劑（Freunds complete adjuvant） 弗氏不完全佐劑 （Freunds incomplete adjuvant, FIA） *是由油劑（石

10、蠟油或植物油）與乳化劑（羊毛脂或Tween80）混合而成，比例為1:1、2:1、3:1或5:1，可根據(jù)需要而定，通常2:1。 *使用時與水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。 弗氏完全佐劑 （Freunds complete adjuvant, FCA） *在弗氏不完全佐劑中加入活卡介苗或死的結(jié)核分枝桿菌（終濃度為220mg/ml），即成為FCA。 *免疫動物時，將弗氏佐劑與抗原按體積 1:1 混合乳化后（油包水）注入動物。 -一般首次注射時用完全佐劑乳化，第二次或第三次注射時用不完全佐劑或不用佐劑。 佐劑與抗原乳化的方法 *研磨法：適于制備大量的佐劑抗原 -先將不

11、完全佐劑加熱，取1.73ml放人無菌玻璃研缽內(nèi)；緩緩滴入0.23ml活卡介苗，邊滴邊按同一方向研磨，使菌體完全分散。 -按同樣方法滴人抗原，每加一滴應(yīng)研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，應(yīng)成為乳白色粘稠的油包水乳劑。 *缺點(diǎn)：研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大，對微量或難得抗原不宜采用。 佐劑與抗原乳化的方法（續(xù)） *注射器混合法 -將等量的完全佐劑和抗原分別吸人兩個5ml注射器內(nèi)，然后插入三通管內(nèi)，交替推動針管混勻，往復(fù)操作直至形成粘稠的乳劑為止。 *優(yōu)點(diǎn)：無菌操作，節(jié)省抗原或佐劑。 *缺點(diǎn)：不易乳化，時間長。 佐劑與抗原乳化的方法（續(xù)） *快速乳化法：利用超聲波粉碎器可快

12、速乳化抗原和佐劑混合物。 -將抗原和佐劑按所需量加入一離心管中，置于超聲波粉碎器上，粉碎頭浸入液面下 0.5cm，離瓶底0.5cm左右，以免打碎離心管。 -每次乳化 1015s，然后置冰箱lmin左右。反復(fù)乳化34次即可完全乳化。管內(nèi)殘余量800r/min離心510min收集。 *優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、節(jié)省材料。 乳化劑的鑒定 *判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上（冷水中），如能長時間保持圓珠形而不散開，表示乳化達(dá)到要求。 （3） 免疫方法免疫途徑 *常有靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)、淋巴結(jié)、腳掌等注射。 *一般采用多點(diǎn)注射方法 -常在足、掌、腋窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等處

13、的皮內(nèi)或皮下。 -皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于提高抗體的效價。 （3） 免疫方法免疫途徑 （續(xù)） *幾點(diǎn)說明： -大動物一般不用腹腔注射 -顆?？乖褪褂米魟r不能靜脈注射 -抗原寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法，只需10100?g抗原即可獲得較好的免疫效果。 -皮內(nèi)注射較困難，特別是天冷時更難注入。 （3） 免疫方法次數(shù)及間隔時間 *次數(shù)一般為23次（初次免疫和加強(qiáng)免疫） -首次注射后，1015天再加強(qiáng)注射； -劑量同首次或?yàn)槭状蔚囊话?，用不全佐劑或不用佐劑?*間隔時間，一般而言，動物越大，間隔越長 -豚鼠、大鼠為78天，兔子為1015天，羊?yàn)?428天； -第三次注射的間隔時間更長些，效果

14、更好。 舉例1：家兔的免疫 *初次免疫 -用50200?g Ag加入FCA，在背部皮下注射68點(diǎn)，每點(diǎn)0.10.2ml，也可肌肉內(nèi)或皮內(nèi)注射； *兩周后，加強(qiáng)免疫 -將50200?g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內(nèi)注射； *抗體效價的檢測：加強(qiáng)免疫一周后，耳緣靜脈采血 -抗體效價測定可用環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、瓊脂雙向擴(kuò)散法等方法。前者抗體效價在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清進(jìn)一步提純。 舉例2：微量抗原淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫家兔 *一般選擇2.53.0kg的新西蘭種公兔 -先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑0.2ml（卡介苗每兔合5mg）； -10天后，見胭窩淋巴結(jié)腫大

15、，然后將抗原注射至腫大的淋巴結(jié)內(nèi)，第一次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化； -以后每隔20天用不完全福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強(qiáng)2次，各次注射的抗原均為2550?g； -末次注射兩周后兔耳放血測價 （可達(dá)1:128）。 舉例3：豚鼠和大鼠的免疫 *初次免疫 -用10100?g Ag加入FCA，在背部皮內(nèi)注射46點(diǎn)，每點(diǎn) 0.lml，也可肌肉內(nèi)或皮下注射； *加強(qiáng)免疫 -每隔 78天，將1050?g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或靜脈注射； *抗體效價的檢測 （4） 免疫劑量 *抗原性強(qiáng)的抗原量應(yīng)小，過大反會引起免疫抑制； *免疫周期長的動物可少量多次注射，短的可大量少次。 （4）

16、免疫劑量 （續(xù)） *各種動物首次免疫抗原劑量和加強(qiáng)免疫的劑量 （5） 抗體效價的檢測 多采免疫雙向擴(kuò)散法 【基本原理】 *指抗原和抗體在同一凝膠內(nèi)都擴(kuò)散，彼此相遇后形成特異性的沉淀線。 -將抗原與抗體分別加入同一凝膠板中兩個相隔一定間距的小孔內(nèi)，使兩者進(jìn)行相互擴(kuò)散，當(dāng)抗原抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成一白色弧狀沉淀線。 *優(yōu)缺點(diǎn)：簡便，但敏感性較低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 免疫雙向擴(kuò)散法的操作步驟 *將玻璃板用水洗凈后用75乙醇沖洗，晾干后放在水平臺上備用。 *將1agar 融化后，置56水浴。 *在玻璃板上鋪膠，約1.5mm 厚，凝固后打孔（直徑 3rnm），孔間距10mm。 *中心孔加5?

17、l 抗原樣品，周圍孔內(nèi)每孔加5?l 抗血清（抗體預(yù)先作系列倍比稀釋即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例）。 *凝膠板置濕盒內(nèi)，室溫擴(kuò)散24h。 *觀察結(jié)果。 抗體效價檢測的其它方法 *環(huán)狀沉淀試驗(yàn)，需較多的抗血清，現(xiàn)已很少用； *對流免疫電泳，比瓊脂免疫雙擴(kuò)散法敏感，較簡便、實(shí)用； *酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ELISA）。 放血或定期抽血 常用以下3種方法 *頸動脈放血法：放血量較多，動物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血約80ml。家兔、山羊、綿羊等動物采血常用此法。 *心臟采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、雞等小動物，但操作不當(dāng)易引起動物死亡。 *靜脈采血：家兔可用耳緣靜

18、脈采血；山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈采血，這種放血法可隔日1次，有時可采集多量血液。 放血或定期抽血 （續(xù)） *采血過程中，動作要輕柔，盡量避免溶血 *血液凝固后，及時離心收集血清，否則細(xì)胞溶解釋放的雜蛋白（例如蛋白水解酶）將污染抗體并將抗體水解，降低效價； *加疊氮化鈉，分裝，低溫保存，也可加一定的保護(hù)劑如BSA、甘油等。 二、組織和細(xì)胞標(biāo)本的制備 *標(biāo)本制備恰當(dāng)，是免疫組化成功的首要條件 *免疫組化對組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求 -保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)； -在原位最大程度地保持待測抗原（或抗體）的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。 *免疫組化的組織和細(xì)胞標(biāo)本，制作流程與常規(guī)處理方

19、法基本相同，但對組織、細(xì)胞的處理又有其特殊要求及注意事項。 -各種抗原由于其含量及特性的差異對標(biāo)本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用于本實(shí)驗(yàn)的最佳方法。 免疫組化中常用的組織和細(xì)胞標(biāo)本 *組織標(biāo)本 -石蠟切片 -冰凍切片 *細(xì)胞標(biāo)本 -組織印片 -細(xì)胞培養(yǎng)片（細(xì)胞爬片） -細(xì)胞涂片 （一） 石蠟切片 *石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法 -最大優(yōu)點(diǎn)是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察； -石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。 *石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數(shù)免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。 1、取材的特殊要求及

20、注意事項 *標(biāo)本新鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴(yán)重彌散。 *取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成自身對照。 -細(xì)胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。 1、取材的特殊要求及注意事項（續(xù)） *避免擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細(xì)胞形態(tài)改變并加深非特異著色，因而取材時應(yīng)使用鋒利的刀刃； -鑷取組織動作要輕； -經(jīng)窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓，觀察結(jié)果時應(yīng)有所考慮。 2、固定及常用的固定液 *取材后的組織需立刻投于固定

21、劑中 -固定使組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，防止組織自溶或異溶，以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)； -對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。 *常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點(diǎn)。 -醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） -醇類（常用乙醇） -其它 （丙酮） （1） 醛類 *甲醛（福爾馬林）應(yīng)用最廣 -原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。 -優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，組織收縮少。 -缺點(diǎn)： *甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； *醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出

22、現(xiàn)空間障礙； *分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘娜旧Y(jié)果。 -注意事項： *縮短固定時間，降低固定溫度（4?C），為此組織塊不宜過厚。 *改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10甲醛固定液，減少固定液pH的變化。 *固定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。 *切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預(yù)處理使抗原再現(xiàn)（抗原修復(fù)）。 *戊二醛： -穿透性強(qiáng)，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。 *多聚甲醛（常用4%）： -可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。 *主要檢測組織內(nèi)

23、一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇（CD）、主要組織相容性抗原等。 （2） 醇類 * 最常用的醇類固定劑是乙醇。 -其固定作用：使細(xì)胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。 -優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存好。 -缺點(diǎn)： *脫水性強(qiáng)，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時間不宜過長（2h內(nèi)）。 *乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度。 （3） 其它固定劑 *丙酮： -對抗原性的保存好，但脫水性更強(qiáng)，較少 用于組織標(biāo)本，但細(xì)胞爬片常用丙酮固定。 3、抗原修復(fù)原因 *常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，結(jié)果使得： -抗原性物質(zhì)形

24、成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇； -蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。 *要求：在染色時，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。 3、抗原修復(fù)方法 *化學(xué)方法 *加熱方法 -水浴加熱法 -微波照射法 -高壓加熱法 -酸水解法 （1） 化學(xué)方法 *主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。 -胰蛋白酶：一般使用濃度為0.050.1，消化時間為37?C，1040min，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示； -胃蛋白酶：一般使用濃度為0.1%0.4，消化時間為37?C、30180min，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。

25、*例如：Laminin、CollagenIV （2） 水浴加熱法 *將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)1015分鐘。 -優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、經(jīng)濟(jì)，適用于所有的實(shí)驗(yàn)室， -缺點(diǎn)：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。 （3） 微波照射法 *將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱至95以上，持續(xù)l015分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進(jìn)行。 *此方法由于微波場內(nèi)極性分子、離子高速運(yùn)動，撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈，使抗原異常的構(gòu)想恢復(fù)正常，且因分子運(yùn)動產(chǎn)熱、效率高、時間短，對抗原再現(xiàn)效果好。 （4） 高壓加熱法暴露抗原 *將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi)，置高壓鍋中高壓*由于高壓下受熱均勻，特別使用于大批

26、量標(biāo)本的染色。 （1） 酸水解法 *酸水解可使交聯(lián)斷裂、暴露抗原。 *將玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室溫作用20min（溫度升高，作用時間縮短）。 *此法能增強(qiáng)特異性染色，降低背景，但需注意水解過度將破壞抗原性及形態(tài)結(jié)構(gòu)。 加熱法的注意事項 *達(dá)到規(guī)定的溫度（9295?C以上）； *維持一定的時間； *避免切片干涸 （抗原可能完全丟失）； *加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻2030分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復(fù)天然構(gòu)型； *修復(fù)液： -最新研究表明堿性修復(fù)液更有效，推薦使用1mM的EDTA緩沖液（pH8.0）。 4、載玻片的處理 *抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓等諸多固素的影響，極易造成脫

27、片。為防止脫片，常用粘附劑處理載玻片。 -新載玻片上有油污，要用洗液浸泡1224h，自來水沖洗后再用蒸餾水清洗；用綢布擦干或烤箱烤干。清潔的載玻片再用粘附劑處理。 *常用的粘附劑有： -APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷） -Polv-L-Lysine（多聚賴氨酸） -鉻明膠溶液 APES（3-aminopropyltriethoxysilane） 3-氨丙基三乙氧基硅烷 *現(xiàn)用現(xiàn)配。用純丙酮或甲醇配制2%APES（v/v）; *將洗凈的玻片浸于此液中2030秒鐘； *取出稍停片刻，再入純丙酮酮溶液洗去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干或60?C烤箱烤干。 Polv-L-Lysine （多聚賴氨酸

28、） *將清潔玻片浸于100?g/ml（10%w/v）的多聚賴氨酸溶液中（去離子水稀釋），37?C放置30min，然后60?C烤箱烘烤1h或室溫過夜干燥。裝盒備用。 鉻明膠溶液 *試劑：鉻明礬（chrome alum） 0.25g 明膠（gelatine） 2.5g 蒸餾水 500ml *先將鉻明礬溶解于40?C少量蒸餾水中，再加入明膠及蒸餾水，可在70 ?C水浴中使明膠溶化，攪拌均勻后，即可使用。如有殘渣，可過濾后再用。 *用時稍加溶化，切片浸入23min，過夜晾干。 （二） 冰凍切片 *冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接切片。 *在切片前組織不經(jīng)過任何化學(xué)藥品處理或加熱過程。 -縮短了制片時

29、間 -抗原性不受損失 *對穩(wěn)定性差的抗原，如淋巴細(xì)胞表面抗原尤其適合。 *組織凍結(jié)過程中，細(xì)胞內(nèi)、外的水分會形成冰晶，凍結(jié)的速度愈慢，冰晶顆粒愈大，可嚴(yán)重影響組織、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此制備凍塊時要求低溫、速凍。 1、冰凍組織塊的常用方法 *液氮中冰凍：組織投入液氮中 （一196?C）中1020sec； *干冰中加入丙酮（或異戊烷），液體立即氣化起泡，溫度降至一70?C ，將組織投入，若在干冰丙酮中置一盛有異戊烷的容器，組織投入該容器內(nèi)結(jié)凍則更好； -上述組織在速凍時應(yīng)浸埋于OCT包埋劑或甲基纖維素糊狀液內(nèi)，以保護(hù)組織。 -制成凍塊后若需保存，應(yīng)以鋁箔或塑料薄膜封包，貯存于-70 ?C冰箱。 2

30、、切片 *供免疫組化用的冰凍切片同樣要求附貼平整，并有連續(xù)性。 *載玻片也應(yīng)清潔無油污，但一般無需涂抹粘附劑； *切片時，使用恒溫冷凍切片機(jī)，在箱內(nèi)溫度-25 ?C 。切片厚度一般為48?m。 3、切片后處理 *切好的冰凍切片，室溫下自然晾干12h后，入4?C丙酮固定10min，待干燥后作免疫組化染色或封存于-20。 *冰凍切片由于切片技術(shù)要求較高，不易得到連續(xù)性很好的切片，其形態(tài)結(jié)構(gòu)亦不如石蠟片，且凍塊和切片不便于長期貯存，因此冰凍切片的應(yīng)用受限。 （三） 組織印片 *將潔凈載玻片輕壓于已暴露病灶的新鮮組織切面，細(xì)胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-

31、20保存。 （四） 細(xì)胞培養(yǎng)片（細(xì)胞爬片） *貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時，置蓋片于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞在蓋片上生長，達(dá)適當(dāng)密度后取出固定（丙酮-20?C固定1020min），再進(jìn)行免疫染色。 -蓋片的處理方法同載玻片的處理，但泡酸時間2h即可。 -為了防止細(xì)胞脫片，可用多聚賴氨酸處理。 （五） 細(xì)胞涂片 *大多數(shù)細(xì)胞涂片由細(xì)胞懸液制成，包括： -血液、尿液、腦脊液； -體腔積液； -組織穿刺吸取，如骨髓、淋巴結(jié)或其他實(shí)質(zhì)性組織 -懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或貼壁細(xì)胞經(jīng)消化后形成的懸液。 （五） 細(xì)胞涂片 （續(xù)） *細(xì)胞涂片的方法： -手涂法 *將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到106/ml左右，可直接涂于載玻片上，但要均勻、不重疊。 *圖

32、片范圍應(yīng)小于1cm直徑，以節(jié)約試劑。 -涂片機(jī)涂片法 *將細(xì)胞樣品制成21056/ml 細(xì)胞懸液，吸取50100?l （121045cells） 加入涂片機(jī)內(nèi)，1000rpm離心2min后細(xì)胞就均勻分布于玻片上。 三、免疫組化常用的染色方法 *根據(jù)標(biāo)記物的不同分為 -（一） 免疫熒光法 -（二） 免疫酶標(biāo)法 -（三） 親和組織化學(xué)法 （一） 免疫熒光法 【原理】 *用于免疫熒光的標(biāo)記物是小分子的熒光素，可標(biāo)記抗體或抗原； *熒光素經(jīng)某種特定波長的光照射激發(fā)后，能發(fā)射出一種比激發(fā)光波波長更長而且能量較低的熒光，籍此可作定位觀察或示蹤； *借助于熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。 1、常用的熒光素 *（1） 異

33、硫氰酸熒光素 （Fluorescein Isothiocyanate, FITC） *（2） 四甲基異硫氰酸羅丹明 （Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC） *（3） 四乙基羅丹明 （RB200） *（4） 碘化丙啶 （propidium iodide, PI） （1） 異硫氰酸熒光素（FITC） *易溶于水和乙醇。 *最大吸收光譜為490495nm，最大發(fā)射光譜為 520530nm呈翠綠色熒光，分子量 389.4。 *在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與Ig的自由氨基形成共價鍵，成為標(biāo)記的熒光抗體。一個lgG分子上最多能標(biāo)記1520

34、個FITC分子。 （2） 四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC） *最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈紅色熒光，分子量為444。 *與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式同F(xiàn)ITC。 （3） 四乙基羅丹明（RB200） *不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。 *最大吸收光譜為570nm，最大發(fā)射光譜為595600nm，呈橙紅色熒光，分子量為580。 *RB200在五氯化磷（PCl5）作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯（SO2Cl），在堿性條件下，易與蛋白質(zhì)的賴氨酸?-氨基反應(yīng)而標(biāo)記在蛋白分子上。 （4） 碘化丙啶（PI） *是常用的DNA熒光標(biāo)記探針，可作為FITC的胞核對比染色。 *PI可嵌入到雙鏈DNA和RNA堿基對中并

35、與之結(jié)合，但對堿基無特異性選擇。 *最大吸收光譜是493nm，最大發(fā)射光譜是630nm，呈紅色熒光。 2、熒光抗體的保存 *一要防止抗體失活，二要保持熒光素不脫落和不受激發(fā)猝滅。 -一般認(rèn)為04?C可保存12年，-20?C可保存34年。 -要小量分裝，防止反復(fù)凍融。 -保存前需加防腐劑 （濃度為1:500010000的硫柳汞或1:10005000疊氮化鈉） 。 3、免疫熒光的染色方法 *免疫熒光染色法常用的有 -直接法 -間接法 原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng) （用來檢測未知抗原）。 直接免疫熒光法的操作步驟 *標(biāo)本的處理： -細(xì)胞涂片、細(xì)胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固

36、定10min，然后用0.0lM PBST （含0.l%TritonX-100 pH 7.4） 漂洗5min 3/次； -石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用0.01M PBST漂洗5min 3/次； *2%BSA或10%BSA37?C濕盒內(nèi)封閉30min *抗體染色： -在標(biāo)本片上滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體（1:8或1:16稀釋），放在濕盒中，37?C孵育30min； ?直接免疫熒光法的操作步驟（續(xù)） *0.0lmol/L PBS（pH 7.4） 漂洗5min 3/次，不時震蕩（洗去多余游離的熒光素標(biāo)記的抗體）。 *緩沖甘油封片 -分析純無熒光的甘油9份+ pH 9.2，0.2

37、M碳酸鹽緩沖液1份配制。 *鏡檢：在熒光顯微鏡下觀察。 *優(yōu)點(diǎn)：方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。 *缺點(diǎn)：敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。若檢測多種抗原需制備多種相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體。 ?直接免疫熒光法的注意事項 *對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋：要保證抗體的蛋白有一定的濃度； *一般稀釋度不應(yīng)超過1:20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。 ?直接免疫熒光法的注意事項 （續(xù)） *染色溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化； -染色時間：從10 min到數(shù)小時，一般30 min； -染色溫度：多采用室溫（25?C），高于37?C可加強(qiáng)染色效果，但對不

38、耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2?C的低溫，延長染色時間。 -低溫染色過夜較37 ?C 30 min效果好的多。 ?直接免疫熒光法的注意事項 （續(xù)） *試驗(yàn)時需設(shè)置下列對照： -自發(fā)熒光對照（空白對照）：標(biāo)本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 -陽性對照：用已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。 -特異性對照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。 *若標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。 ?直接免疫熒光法的注意事項 （續(xù)） *一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象

39、； *經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強(qiáng)度會逐漸下降。 （2） 間接法又稱為熒光抗-抗體法 ? 需要兩種抗體參與，即一抗和二抗（熒光素標(biāo)記）。一抗對標(biāo)本中的抗原來說起抗體的作用，但對熒光標(biāo)記的二抗來說又起著抗原作用。 -可用來檢測標(biāo)本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。 ?間接免疫熒光法操作步驟 *標(biāo)本的處理及非特異染色的封閉同直接法； *一抗染色： *0.01M PBST漂洗5min3次（震蕩漂洗）； ?間接免疫熒光法操作步驟（續(xù)） * 加熒光標(biāo)記的二抗抗體，37?C濕盒避光作用30min。 *0.01M PBST避光漂洗5min3次（例如包上錫紙，在搖床上漂洗）； *甘

40、油緩沖液封片 *鏡檢 *優(yōu)點(diǎn)：敏感性較高，比直接法高10倍左右；制備一種熒光標(biāo)記抗體，可應(yīng)用于多種一抗； *缺點(diǎn)：是參加反應(yīng)的因子較多，產(chǎn)生非特異性染色的機(jī)會增多。 ?間接免疫熒光法的注意事項 *熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。 *每次試驗(yàn)時 ，需設(shè)置以下三種對照： -陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物 -陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物 -熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物 ?間接免疫熒光法的注意事項（續(xù)） *標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。 *一抗和二抗應(yīng)始終保持在標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。 （二）

41、 免疫酶酶標(biāo)法 【原理】 *以酶作為標(biāo)記物與外加底物作用后產(chǎn)生不溶性色素，沉積于抗原和抗體反應(yīng)的部位； *酶降解底物的量與色澤濃度成正比?？煞从潮粶y定的抗原或抗體的量。 1、常用的標(biāo)記酶及其顯色底物 *辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）及底物 *堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）及底物 （1） 辣根過氧化物酶（HRP）及底物 *HRP是應(yīng)用最廣的一種酶，來源于植物辣根，由無色的酶蛋白和深棕色的鐵葉琳結(jié)合而成，分子量約40kDa，穩(wěn)定性好； *底物為過氧化物和供氫體（DH2） -過氧化物：常用過氧化氫和過氧化氫尿素。 -供氫體：多

42、用無色的還原型染料，通過反應(yīng)生成有色的氧化 型染料，最常用的供氫體是DAB。 DAB （二氨基聯(lián)苯胺） *DAB本身無色，反應(yīng)后呈棕色，不溶于水，不易褪色，電子密度高，最為常用。 *目前已經(jīng)有商品化的試劑盒，使用起來非常方便。 （2） 堿性磷酸酶（AP）及底物 *AP為磷酸酯的水解酶，可通過兩種反應(yīng)顯色： -偶氮偶聯(lián)反應(yīng)，底物為?-萘酚磷酸鹽，經(jīng)水解后得?-萘酚，與重氮化合物如堅牢藍(lán)（fast blue）或堅牢紅（fast red）形成不溶性沉淀，分別呈蘭色或紅色。 -靛藍(lán)-四唑反應(yīng)：底物為溴氯羥吲哚磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP），

43、經(jīng)酶水解并氧化形成靛藍(lán)，而氮藍(lán)四唑（NBT）在此氧化過程中被還原成不溶性紫蘭色沉淀。 2、常用的免疫酶染色方法 *又分為以下兩種方法： -酶標(biāo)抗體法 *直接法 *間接法 -非標(biāo)記抗體酶法 *酶橋法 *PAP法 （1） 酶標(biāo)抗體法 *通過共價鍵將酶結(jié)合在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，與標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)后，再用酶組化法將酶顯色，使之生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，以供光鏡和電鏡觀察。 -優(yōu)點(diǎn)：切片能長期保存、反復(fù)觀察，適于鏡下半定量分析。 -缺點(diǎn)：酶與抗體形成的共價鍵，可損害抗體和酶的活性；易產(chǎn)生非特異染色。 （1） 酶標(biāo)抗體法直接法 ? 將酶直接標(biāo)記在一抗上，然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成

44、抗原-抗體-酶復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。 （1） 酶標(biāo)抗體法間接法 *將酶標(biāo)記在二抗上，先將一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用二抗（酶標(biāo)抗體）與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟 *標(biāo)本準(zhǔn)備： -石蠟脫蠟至水； -冰凍切片浸入4?C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min3； -細(xì)胞爬片先用PBS洗，然后4?C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min3； *石蠟切片需要進(jìn)行抗原修復(fù)，其它標(biāo)本則不用； （2） 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟（續(xù)） *封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3H2O2-甲醇溶液室溫孵育510min （濕盒內(nèi)） ； *0.01M PBST漂洗，5min3； *510%正常山羊血清（0.01M PBS稀釋）封閉，室溫孵育30min （濕盒內(nèi)） ； *傾去血清勿洗，加1BSA（PBST配制）稀釋的一抗， 37?C孵育60min 或4?C過夜（濕盒內(nèi)）； （2） 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟（續(xù)） *0.01M PBST漂洗，5min3； *加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育lh或37?C 30min ； *加0.01H2O20.05DAB顯色 （顯色液