免疫抑制劑對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響

1、免疫抑制劑對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響(1)作者：袁文丹，高峰，陳金榮，劉麗，王國祥【摘要】 目的 研究免疫抑制劑對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(Macrophage ，M)的損傷作用機(jī)制。方法 以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為對(duì)象，采用小鼠尾靜脈注射地塞米松0.15mg/只，環(huán)磷酰胺2.0mg/只，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)，檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及腹腔灌洗液中NO2-/NO3-濃度并用形態(tài)學(xué)方法觀察比較免疫抑制劑對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的損傷特點(diǎn)。結(jié)果 地塞米松和環(huán)磷酰胺均能抑制巨噬細(xì)胞功能，與對(duì)照組比，細(xì)胞吞噬功能均顯著下降（P0.01），DEX組腹腔灌洗液中NO2-/NO3-濃度顯著升高，Cy組不升高。VitC為自由基

2、鏈反應(yīng)阻斷劑，阻斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可減輕損傷，可使DEX組細(xì)胞吞噬功能獲得部分恢復(fù)。結(jié)論 推測環(huán)磷酰胺對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞損傷是以直接損傷染色體而DEX以氧化損傷為主?！娟P(guān)鍵詞】 地塞米松 環(huán)磷酰胺 巨噬細(xì)胞The effect of dexamethasone and cyclphosphamide on peritoneal macrophage of mice【Abstract】 Objective We investigated demage mechanism of peritoneal macrophage(M) induced by injection of dexamethasone

3、and cyclophosphamide in mice.Methods The immune function by determining the phagocytic function and structure of the macrophagocytes of the abdominal cavities of mice in vitro. The phagocytosis of peritoneal macrophages was evaluated by chicken erythrocytes method; Observed the concentratuon of NO-2

4、/NO-3 in the peritoneal lavage fluid.Results Dexamethasone and cyclophosphamide induced the apoptosis of peritoneal macrophage and concomitant decrease of phagocytosis(vs control group，P0.01)， the concentratuon of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid significantly increased after dexamethasone i

5、njection;VitC(inhibitor of iNOS and inhibitor of reactive oxygen species) prevented the apoptosis of peritoneal macrophage and reduced the concentration of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid after the effect of dexamethasone.Conclusion These evidences support that NO and active oxygen species

6、may be involved in the apoptosis process of peritoneal peritoneal macrophage induced by dexamethasone in mice.【Key words】 dexamethasone cyclophosphamide macrophage地塞米松和環(huán)磷酰胺在臨床腫瘤的治療中是常用的藥物，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)又會(huì)引起免疫系統(tǒng)損傷，而影響治療效果。巨噬細(xì)胞(macrophage，M)是機(jī)體免疫體系中重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有非特異性直接清除各種異物，殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞的功能，并具有抗原提呈作用。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠腹

7、腔巨噬細(xì)胞進(jìn)一步探討在整體條件下地塞米松和環(huán)磷酰胺對(duì)免疫功能影響的機(jī)制。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物處理 昆明種雄性小鼠，日齡5558天。60只分為5組：正常對(duì)照組；DEX組：腹腔注射地塞米松（Dexa）150g/只，每日1次，連續(xù)注射3次；Cy組：腹腔注射環(huán)磷酰胺（Cy）1.5mg/只，每日1次，連續(xù)注射3次；VitC DEX組：與DEX組同時(shí)注射；VitC Cy組：與Cy同時(shí)注射；給藥第2天上述小鼠腹腔注射2%無菌淀粉1ml。1.2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定 于第4天取各組6只，小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞1ml，30min后，引頸處死小鼠，腹腔注射D-HanKs 1ml，輕輕按揉腹

8、壁1min，吸出腹腔液滴片。置37C濕盒孵育30min后，用PBS沖洗，去除未貼壁M和游離雞紅細(xì)胞，1：1丙酮-甲醇固定78min，自然晾干。有姬母薩-瑞士染液進(jìn)行染色，油鏡下計(jì)數(shù)M和M吞噬CRBC數(shù)。用下列公式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)：吞噬百分率（%）=吞噬雞紅細(xì)胞的M/100個(gè)M（吞和未吞的）100% 吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100個(gè)M。1.3 細(xì)胞涂片Giemsa染色 各組小鼠第4天引頸處死，腹腔注射D-Hanks液5ml，吸出腹腔液4 500r/min，去上清與PBS制成細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞為1106個(gè)/ml，100l涂片，涼干后甲醇固定，晾干Giemsa染色，普通光鏡下觀察細(xì)胞形

9、態(tài)變化。1.4 腹腔巨噬細(xì)胞NO檢測 NO2-/NO3-的測定按NO試劑盒（酶法）說明書操作，最后測定500nm吸光度值。NO2-/NO-3（mol/L）=（樣品管吸光度空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)吸光度空白管吸光度）。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并采用Student-NK檢驗(yàn)法進(jìn)一步檢驗(yàn)。腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定結(jié)果見表1。DEX和Cy注射組小鼠M的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均明顯降低，與生理鹽水對(duì)照組比較具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）;VitC DEX組M的吞噬百分率和吞噬指數(shù)比DEX組有顯著提高（P0.05）。形態(tài)學(xué)變化可見：DEX組和Cy組較對(duì)照組出現(xiàn)明顯形態(tài)變化

10、細(xì)胞變小，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞質(zhì)濃縮，可見凋亡小體。腹腔巨噬細(xì)胞NO檢測結(jié)果見圖1：小鼠腹腔灌洗液中NO濃度測定顯示：與對(duì)照組比，DEX組NO2-/NO-3濃度顯著上升（P0.01），而VitC能部分逆轉(zhuǎn)NO濃度（P0.05）。表1 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定結(jié)果注：與對(duì)照組比較，P0.01;與對(duì)照組比較，P0.01;與DEX組比較，P0.05圖1 腹腔巨噬細(xì)胞NO檢測結(jié)果注：與對(duì)照組比較，P0.01;與DEX組比較，P0.01，與DEX組比較，P0.01;與Cy組比較，P0.053 討論巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫體系中重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)選用腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的方法來觀察免疫抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞

11、的影響。結(jié)果可見，免疫抑制劑可顯著抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力；VitC能明顯改善地塞米松對(duì)巨噬細(xì)胞的影響。文獻(xiàn)報(bào)道抗氧化劑VitC通過清除氧自由基和降低脂質(zhì)過氧化提高機(jī)體免疫功能13。機(jī)體氧化-抗氧化的平衡對(duì)維持正常的免疫功能具有重要的作用，它影響到免疫細(xì)胞膜磷脂、細(xì)胞內(nèi)蛋白、核酸的完整性和免疫信號(hào)的傳導(dǎo)及基因表達(dá)。免疫細(xì)胞由于其細(xì)胞膜磷脂含有較高的不飽和脂肪酸，因此對(duì)氧應(yīng)激非常敏感4。已有實(shí)驗(yàn)證明VitC有很強(qiáng)的抗氧化作用，注射VitC可明顯減弱DEX對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的抑制作用，分析DEX對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫抑制作用可能與其氧化損傷有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道5抗氧化劑維生素C通過抑制DEX誘導(dǎo)的淋巴

12、細(xì)胞凋亡增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖能力，VitC具有抗氧化作用，提示通過抗氧化促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制DEX誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的凋亡。巨噬細(xì)胞具有非特異性直接清除各種異物，殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞的功能6。靜止的巨噬細(xì)胞胞體小，細(xì)胞活性低，吞噬功能弱。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活后，細(xì)胞胞體變大、表面突起增多，細(xì)胞內(nèi)有完整的細(xì)胞器，且溶酶體、線粒體增多，細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VitC改善巨噬細(xì)胞吞噬功能，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，VitC處理的M細(xì)胞表面突起增多，細(xì)胞伸展率提高并能對(duì)抗DEX引起的細(xì)胞變小，伸展性差，細(xì)胞聚集成團(tuán)現(xiàn)象。有研究報(bào)道DEX可降低M的吞噬作用7，8，Grasso等9研究發(fā)現(xiàn)DEX與M體外共同孵育可抑制M細(xì)胞吞噬功能，但培養(yǎng)液中一旦去除DEX，M吞噬功能很快便得到恢復(fù)。DEX具有誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的作用10。M凋亡的機(jī)制十分復(fù)雜，近年的研究發(fā)現(xiàn)許多因素與M凋亡有關(guān)。巨噬細(xì)胞受到刺激或進(jìn)行吞噬作用后，發(fā)生呼吸暴發(fā)，可產(chǎn)生大量的活性氧及NO等活性物質(zhì)11。是巨噬細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮獨(dú)特作用的基礎(chǔ)，一定濃度的NO又是M凋亡信息傳遞通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過調(diào)控巨噬細(xì)胞自身凋亡保持巨噬細(xì)胞數(shù)量恒定12。有研究報(bào)道凋亡時(shí)活性氧和NO或減少或增多13，機(jī)制尚不清。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示DEX誘導(dǎo)巨