蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

1、四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (一一) )膠體性質(zhì)膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量1 1萬萬-100-100萬之間，其分子直萬之間，其分子直徑徑1-1001-100nmnm之間，在膠體顆粒的范圍。之間，在膠體顆粒的范圍。蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因為在水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因為在蛋白質(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團，如蛋白質(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團，如 NHNH3 3、 COOCOO- -、 OHOH- -、 SHSH、 CONHCONH2 2等和水有高度親和性等和水有高度親和性，當?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇時，就很容易在蛋白質(zhì)顆粒，當?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇

2、時，就很容易在蛋白質(zhì)顆粒外面形成外面形成層水膜。層水膜。 所以蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如所以蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如布朗運布朗運動動、光散射光散射、電泳電泳、不能透過半透膜不能透過半透膜及及具具有吸附能力有吸附能力等等。利用蛋白質(zhì)不能透過半透。利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，可用羊皮紙、火棉膠、玻璃紙膜的性質(zhì)，可用羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等來分離純化蛋白質(zhì)，這個方法稱等來分離純化蛋白質(zhì)，這個方法稱透析（透析（dialysis）。）。 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (一一) )膠體性質(zhì)膠體性質(zhì)( (二二) )兩性解離及等電點兩性解離及等電點 蛋白質(zhì)同氨基酸一樣也是兩性電解質(zhì)，即能和蛋白質(zhì)

3、同氨基酸一樣也是兩性電解質(zhì)，即能和酸作用，也能和堿作用。蛋白質(zhì)分子中可解離的基酸作用，也能和堿作用。蛋白質(zhì)分子中可解離的基團除肽鏈末端的團除肽鏈末端的 - -氨基和氨基和 - -羧基外，主要還是多肽羧基外，主要還是多肽鏈中氨基酸殘基上的側(cè)鏈基團如鏈中氨基酸殘基上的側(cè)鏈基團如 - -氨基、氨基、 - -羧基、羧基、 - -羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pHpH條件下，這些基團能解離為帶電基團從而使蛋白條件下，這些基團能解離為帶電基團從而使蛋白質(zhì)帶電。質(zhì)帶電。 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì) 蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點（pIpI）

4、：）：當某蛋白質(zhì)在一定的當某蛋白質(zhì)在一定的pHpH的溶液中，所帶的正負電荷相等，它在電場中既不向的溶液中，所帶的正負電荷相等，它在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的陽極也不向陰極移動，此時溶液的pHpH值叫做該蛋白質(zhì)值叫做該蛋白質(zhì)的等電點。的等電點。酸性蛋白、堿性蛋白酸性蛋白、堿性蛋白 蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)與溶液的蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)與溶液的pHpH有關。利用蛋白質(zhì)有關。利用蛋白質(zhì)的兩性解離可以通過電泳分離純化蛋白質(zhì)。的兩性解離可以通過電泳分離純化蛋白質(zhì)。四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (二二) )兩性解離及等電點兩性解離及等電點 蛋白質(zhì)受到某些理化因素的影響，其空間結構蛋白質(zhì)受

5、到某些理化因素的影響，其空間結構發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學功能隨之改發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學功能隨之改變或喪失，但未導致蛋白質(zhì)一級結構的改變，這種變或喪失，但未導致蛋白質(zhì)一級結構的改變，這種現(xiàn)象叫現(xiàn)象叫變性作用變性作用（denaturationdenaturation）。 1.蛋白質(zhì)變性的概念2.蛋白質(zhì)變性的因素物理因素物理因素：加熱、紫外線、超聲波、高壓等；：加熱、紫外線、超聲波、高壓等；化學因素化學因素：強酸、強堿、脲、鹽酸胍、去垢：強酸、強堿、脲、鹽酸胍、去垢劑、重金屬鹽等；劑、重金屬鹽等； ( (三三) )蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要

6、性質(zhì)3.蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (三三) )蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性4.蛋白的復性 蛋白質(zhì)的變性作用若不過于劇烈，則是一種可蛋白質(zhì)的變性作用若不過于劇烈，則是一種可逆過程。高級結構松散了的變性蛋白質(zhì)通常在除去逆過程。高級結構松散了的變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊形成原來的構變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊形成原來的構象，恢復原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象稱象，恢復原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象稱為為復性復性( (renaturation)renaturation)。 大多蛋白質(zhì)變性后，很難復性。大多蛋白質(zhì)變性后，很難復性。四

7、四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (三三) )蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性( (四四) )蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀 加入適當試劑使蛋白質(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去加入適當試劑使蛋白質(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層，蛋白質(zhì)的膠體溶液就不穩(wěn)定水化層，蛋白質(zhì)的膠體溶液就不穩(wěn)定, ,并將產(chǎn)生沉淀。并將產(chǎn)生沉淀。能使蛋白質(zhì)沉淀的試劑有：能使蛋白質(zhì)沉淀的試劑有：1. 1. 高濃度中性鹽高濃度中性鹽 （NHNH4 4) )2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl（中和蛋白質(zhì)的電荷）中和蛋白質(zhì)的電荷） 這種加入鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱為這種加入鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析

8、鹽析，用于蛋白質(zhì)分離制備。用于蛋白質(zhì)分離制備。2. 2. 有機溶劑有機溶劑 丙酮、乙醇丙酮、乙醇 ( (破壞蛋白質(zhì)水膜破壞蛋白質(zhì)水膜) )四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)3.3.重金屬鹽重金屬鹽 Hg Hg2+2+、AgAg+ +、PbPb+ + （與蛋白質(zhì)中帶負電基團形與蛋白質(zhì)中帶負電基團形成不易溶解的鹽成不易溶解的鹽, ,或改變蛋白質(zhì)的空間結構或改變蛋白質(zhì)的空間結構） 4.4.生物堿試劑生物堿試劑 苦味酸、目酸、鎢酸等苦味酸、目酸、鎢酸等 （與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團生成不溶性鹽）（與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團生成不溶性鹽）四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (四四) )蛋白

9、質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀( (五五) )蛋白質(zhì)的顏色反應蛋白質(zhì)的顏色反應1. 1. 雙縮脲反應雙縮脲反應 雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。雙雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應產(chǎn)生紅紫色絡合縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應產(chǎn)生紅紫色絡合物，此反應稱雙縮脲反應。蛋白質(zhì)分子中含有許多物，此反應稱雙縮脲反應。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應和雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應。通?？捎么朔磻獊矶ㄐ澡b定蛋白質(zhì)，也可根據(jù)反。通?？捎么朔磻獊矶ㄐ澡b定蛋白質(zhì)，也可根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色深淺在應產(chǎn)物的顏色深淺在540540nmnm處進行蛋白

10、質(zhì)的定量測定處進行蛋白質(zhì)的定量測定。 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)2. 2. 酚試劑（酚試劑（Folin-酚試劑）反應酚試劑）反應 蛋白質(zhì)分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸蛋白質(zhì)分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將中的酚基能將Folin-酚試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸酚試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍色化合物（即鉬藍和鎢藍的混合物）。還原成藍色化合物（即鉬藍和鎢藍的混合物）。這一反應常用來定量測定蛋白質(zhì)含量。這一反應常用來定量測定蛋白質(zhì)含量?？筛鶕?jù)反可根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色深淺在應產(chǎn)物的顏色深淺在540540nmnm處進行蛋白質(zhì)的定量處進行蛋白質(zhì)的定量測定測定. . 四四. .蛋白質(zhì)的

11、重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (五五) )蛋白質(zhì)的顏色反應蛋白質(zhì)的顏色反應3. 3. 茚三酮反應茚三酮反應 由于蛋白質(zhì)多肽鏈兩端有游離的由于蛋白質(zhì)多肽鏈兩端有游離的 -NH2和和 -COOH，所以蛋白質(zhì)也可以和茚三酮發(fā)生反應。所以蛋白質(zhì)也可以和茚三酮發(fā)生反應。4. 考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭 與蛋白質(zhì)反應形成藍色透明物質(zhì)，在與蛋白質(zhì)反應形成藍色透明物質(zhì)，在595nm下進行比色。下進行比色。四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (五五) )蛋白質(zhì)的顏色反應蛋白質(zhì)的顏色反應( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定1.1.蛋白質(zhì)分離、純化的過程和一般原則蛋白質(zhì)分離、純化的

12、過程和一般原則 （1 1）前處理（）前處理（Pretreatment）-細胞破碎，蛋白細胞破碎，蛋白質(zhì)從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來。質(zhì)從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來。（2 2）粗分級（）粗分級（Rough fractionation） 當?shù)鞍踪|(zhì)混當?shù)鞍踪|(zhì)混合物的提取液獲得后，選用一套適當分離純化方法合物的提取液獲得后，選用一套適當分離純化方法，使目的蛋白與大量的雜蛋白分離開。，使目的蛋白與大量的雜蛋白分離開。 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)1 1. .蛋白質(zhì)分離、純化的過程和一般原則蛋白質(zhì)分離、純化的過程和一般原則 （3 3）細分級（）細分級（Fine fra

13、ctionation） 是將樣品進是將樣品進一步提純的過程。樣品經(jīng)粗分級以后，一般體積較一步提純的過程。樣品經(jīng)粗分級以后，一般體積較小，雜蛋白已經(jīng)大部分被除去。小，雜蛋白已經(jīng)大部分被除去。（4 4）結晶（）結晶（Crystal）由于結晶中從未發(fā)現(xiàn)過變性由于結晶中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的結晶不僅是純度的一個標志蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。蛋白質(zhì)，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。蛋白質(zhì)純度愈高，溶液愈濃就愈容易結晶。純度愈高，溶液愈濃就愈容易結晶。 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、

14、純化與鑒定的分離、純化與鑒定2.2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法蛋白質(zhì)分離純化的一般方法 （1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法透析和超濾透析和超濾 透析（透析（dialysis）a. 和超濾（和超濾（ultrafiltration）四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定2.2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法蛋白質(zhì)分離純化的一般方法 （1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法b. 密度梯度（區(qū)帶）離心密度梯度（區(qū)帶）離心 c. 凝膠過濾（凝膠過濾（gel filtrat

15、ion） 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)葡聚糖凝膠過濾2.2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法蛋白質(zhì)分離純化的一般方法 （2）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行分離的方法根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行分離的方法 等電點沉淀（等電點沉淀（isoelectric precipitation）蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析 有機溶劑分級分離有機溶劑分級分離 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定2.2.蛋白質(zhì)分離純化的一般

16、方法蛋白質(zhì)分離純化的一般方法 （3）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法 電泳電泳-在電場中，帶電顆粒向著與其帶相反電荷的在電場中，帶電顆粒向著與其帶相反電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱電泳（電極移動，這種現(xiàn)象稱電泳（electrophoresis）。）。四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定n影響遷移率的因素：電位梯度影響遷移率的因素：電位梯度 電流密度電流密度 導電性導電性 環(huán)境環(huán)境pH （分子電荷）分子電荷） 離子強度離子強度 分子的大小、形狀分子的大小、形狀 n根據(jù)電泳的原理和影響因素可以設計不同的

17、電根據(jù)電泳的原理和影響因素可以設計不同的電泳方法以達到預期的目的泳方法以達到預期的目的四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)n按分離的原理分：區(qū)帶電泳按分離的原理分：區(qū)帶電泳 移界電泳移界電泳 等速電泳等速電泳 等電聚焦等電聚焦n按有無支持物分：自由電泳按有無支持物分：自由電泳 支持物電泳支持物電泳四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)n第一代固體介質(zhì)：第一代固體介質(zhì)： 紙，醋酸纖維素薄膜，硅膠等紙，醋酸纖維素薄膜，硅膠等 n第二代固體介質(zhì)：第二代固體介質(zhì)： 淀粉，聚丙烯酰胺淀粉，聚丙烯酰胺 （多用于蛋白質(zhì)），（多用于蛋白質(zhì)）， 瓊脂糖（多用于核酸分離）瓊脂糖（多用于核酸分離）四四.

18、.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)聚丙烯酰胺的結構和特點聚丙烯酰胺的結構和特點 單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺 增速劑：增速劑：TEMEDTEMED（N,N,N,N-N,N,N,N-四甲基乙二胺）、四甲基乙二胺）、3-3-二甲胺丙腈二甲胺丙腈 引發(fā)劑：過硫酸銨、過硫酸鉀、核黃素引發(fā)劑：過硫酸銨、過硫酸鉀、核黃素 特性：機械性能、彈性、透明度、粘著度、孔徑特性：機械性能、彈性、透明度、粘著度、孔徑大小大小n電泳原理：電泳原理：1.1.最主要的特性是蛋白質(zhì)的帶電行為，產(chǎn)生最主要的特性是蛋白質(zhì)的帶電行為，產(chǎn)生電荷效應電荷效應2.2.分子篩效應分子篩效應3.3.分子形狀分

19、子形狀四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)2.2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法蛋白質(zhì)分離純化的一般方法 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定（3）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法 b. 離子交換層析（離子交換層析（ion-exchange chromatography） 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定2.2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法蛋白質(zhì)分離純化的一般方法 （3）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分

20、離方法 親和層析法親和層析法c. （affinity chromatography） 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定3.3.蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子量的測定方法分子量的測定方法 凝膠過濾測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量凝膠過濾測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量 凝膠過濾層析法（凝膠過濾層析法（gel filtration gel filtration chromatographychromatography）或稱為分子排阻層析（或稱為分子排阻層析（size size exclusionexclusion）或分子篩層析（或分子篩層析（molecular sieve molecular sieve chromatographychromatography）能夠測定完整的蛋白質(zhì)分子質(zhì)能夠測定完整的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量量四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)( (六六) )蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定3.3.蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子量的測定方法分子量的測定方法 (2) (2) SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）十二烷基硫酸鈉）-PAGE-PAGE測定蛋白質(zhì)分子測定蛋白質(zhì)分子量量 四四. .蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋