應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)環(huán)境中軍團(tuán)菌的調(diào)查研究

1、應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)環(huán)境中軍團(tuán)菌的調(diào)查研究沈莉 謝曉紅 韓華忠 陶力新 袁建華 王仁剛上海市奉賢區(qū)疾病預(yù)防控制中心 201400摘要目的： 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)奉賢地區(qū)部分公共場(chǎng)所空調(diào)冷卻塔水及其它環(huán)境（淋浴設(shè)施等）進(jìn)行軍團(tuán)菌污染狀況調(diào)查。方法：在五月和十月，分別采集中央空調(diào)冷卻塔水樣品及環(huán)境樣品用聚合酶鏈（PCR）對(duì)其進(jìn)行軍團(tuán)菌檢測(cè)，同時(shí)用常規(guī)法進(jìn)行分型鑒定。結(jié)果：采集的125份樣品中，PCR法檢出軍團(tuán)菌45份，陽(yáng)性檢出率為36%，且水樣檢出率遠(yuǎn)高于環(huán)境。在檢出的59株軍團(tuán)菌中共鑒定出6種不同菌型，其中LP1為重點(diǎn)菌型，占50.85%。且在同一樣品中檢出不同菌型有2株以上的占35.29%。結(jié)

2、論：奉賢地區(qū)中央空調(diào)冷卻塔及環(huán)境中存在軍團(tuán)菌污染，需引起重視，以防止軍團(tuán)菌的爆發(fā)流行。關(guān)鍵詞：軍團(tuán)菌 冷卻塔 PCRApplication of molecular biology technology on the environment in the investigation of Legionella Shen li,Xie Xiaohong,Han Huazhong,et al .Fengxian district Center for Disease Prevention and Control,shanghai201400,china.AbstractObjective：Maki

3、ng a survey by techniques of Applied Molecular Biology, which is about the condition of Legionella contamination in air-conditioning cooling tower water and other environments (shower facilities, etc in some public places in Fengxian District.Methods：In May and October, inspecting the samples of cen

4、tral air-conditioning cooling tower water and other environments respectively on Legionella by polymerase chain (PCR, while making a classification identification by routine techniques. Results：Among the 125 samples collected, Legionella was found in 45 samples by PRC, relevance ratio of masculine g

5、ender was 36%, which was higher in water than in other environments. There were 6 different bacteria types identified in the detection of 59 pieces of Legionella. LP1 was the important bacteria type among the 6, accounting for 50.85%. The fact that more than 2 types in one sample accounts for 35.29%

6、.Conclusions：Legionella contamination exists in air-conditioning cooling tower water and other environments in Fengxian District, which should be paid attention to in order to prevent the outbreak of Legionella.KeywordLegionella ;Cooling tower ;PCR軍團(tuán)菌是一種革蘭氏陰性桿菌，能引起急性呼吸道傳染病1，因在1976年美國(guó)費(fèi)城召開的退伍軍人大會(huì)時(shí)爆發(fā)流行

7、而得名。自70年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，全世界已有廣泛報(bào)道，全球每年都有數(shù)起軍團(tuán)菌爆發(fā)流行，WHO也已正式把它列入疾病傳報(bào)范圍。迄今為止，軍團(tuán)菌已被發(fā)現(xiàn)存在40個(gè)種，60多個(gè)血清型。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查研究，這種細(xì)菌存在于各種自然界水源以及空調(diào)水管道，供水系統(tǒng)等人工水源中，在引進(jìn)空調(diào)冷卻塔做冷卻水時(shí)，隨空調(diào)器把細(xì)菌散布于室內(nèi)空氣中，被人吸入而引發(fā)肺炎。我國(guó)自1982年南京首次證實(shí)軍團(tuán)菌病例以來(lái)已有多起軍團(tuán)菌爆發(fā)流行2，上海在近幾年內(nèi)也從病人和環(huán)境中分離到軍團(tuán)菌3。而上海地區(qū)健康人血清抗體水平調(diào)查也證明軍團(tuán)菌早已存在我們周圍并對(duì)人群構(gòu)成潛在威脅4。近年來(lái)從軍團(tuán)菌的流行可以看出軍團(tuán)菌對(duì)人類健康的威脅已達(dá)到不容忽視

8、的程度。隨著人們生活水平的提高，其發(fā)病率有上升趨勢(shì)，因此對(duì)該病的研究也越來(lái)越受到人們的重視。目前用于軍團(tuán)菌檢測(cè)的常規(guī)培養(yǎng)費(fèi)時(shí)約7-10天，不僅花費(fèi)大量時(shí)間和精力，還具有敏感性，特異性差的缺點(diǎn)，且操作復(fù)雜，易造成漏檢和誤檢。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為軍團(tuán)菌檢測(cè)提供了新的契機(jī)。利用聚合酶鏈（PCR）技術(shù)能夠更加快速和有效的對(duì)軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測(cè)。本課題應(yīng)用聚合酶鏈（PCR）技術(shù)，檢測(cè)流行環(huán)境中的軍團(tuán)菌，了解分析奉賢地區(qū)軍團(tuán)菌的污染狀況。1 材料與方法1.1 材料培養(yǎng)基 GVPC平板由柯瑪嘉公司提供，血瓊脂平板，各反應(yīng)試劑由上海市疾病預(yù)防控制中心提供，均在有效期內(nèi)使用。1.2 方法2培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行鑒定5。

9、2 結(jié)果2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果一共采集125份樣品進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)，有45份樣品檢出陽(yáng)性。經(jīng)上海生工生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證,送檢的陽(yáng)性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物確認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌。M:100bpDNA標(biāo)準(zhǔn)帶；1:嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性對(duì)照;2:陰性對(duì)照;3-15:部分樣品擴(kuò)增條帶特異性引物只與嗜肺軍團(tuán)菌發(fā)生陽(yáng)性擴(kuò)增，擴(kuò)增長(zhǎng)度為430bp，其它干擾菌沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，具有很好特異性。結(jié)果見圖2。M:100bpDNA標(biāo)準(zhǔn)帶；1: 嗜肺軍團(tuán)菌;2:空白對(duì)照(不加模板; 3: 腸炎沙門菌; 4:宋內(nèi)氏志賀菌; 5:大腸埃希菌; 6:副溶血性弧菌 2.2 樣品檢測(cè)情況用PCR檢測(cè)的125份樣品中，水樣64份，環(huán)境樣品61份，

10、水樣的陽(yáng)性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于環(huán)境中的陽(yáng)性檢出率。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，水樣與環(huán)境樣品檢出率的比較（X2 =55.37， P0.05），有顯著性差異。詳見表1表1: PCR法檢測(cè)125份軍團(tuán)菌樣品情況樣品種類 檢測(cè)件數(shù) 陽(yáng)性數(shù)（份） 陽(yáng)性檢出率（%） 水樣 64 43 67.19環(huán)境 61 2 3.28 合計(jì) 125 45 362.3 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較64份水樣樣品中PCR法檢測(cè)出陽(yáng)性菌43份，陽(yáng)性檢出率67.19%。常規(guī)法檢出陽(yáng)性數(shù)32份，陽(yáng)性檢出率為50%，略低于PCR法。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法檢出率比較（X2 =3.90，P0.05），有顯著性差異。而在環(huán)境樣品中，由于陽(yáng)性檢出率很低，無(wú)明顯差別。

11、詳見表2、表3表2: 水樣樣品中兩種方法檢出情況檢測(cè)方法 檢測(cè)件數(shù) 陽(yáng)性數(shù)（株） 陽(yáng)性檢出率（%） PCR法 64 43 67.19常規(guī)法 64 32 50 合計(jì) 128 75 58.59表3: 環(huán)境樣品中兩種方法檢出情況檢測(cè)方法 檢測(cè)件數(shù) 陽(yáng)性數(shù)（株） 陽(yáng)性檢出率（%） PCR法 61 2 3.28常規(guī)法 61 2 3.28 合計(jì) 122 4 6.562.4 軍團(tuán)菌的菌型分布情況在125份樣品中檢出了59株軍團(tuán)菌。其菌型分布為L(zhǎng)P1型占50.85%，LP4型占23.73%，LP5型占10.17%，LP6型占8.47%，LP7型占3.39%，LP8型占3.39%。而同一份樣品中檢出3株菌型的有

12、4份，占陽(yáng)性樣品的11.76%，同份樣品檢出2株菌型的有8份，占23.53%。詳見表4、表5表4：125份樣品59株軍團(tuán)菌的菌型分布情況樣品種類 菌株檢出數(shù) 嗜肺軍團(tuán)菌菌型 LP1 LP4 LP5 LP6 LP7 LP8水樣 57 30 14 6 3 2 2環(huán)境 2 2合計(jì) 59 30 14 6 5 2 2表5：同份樣品檢出多重菌株情況同份樣品檢出菌株數(shù) 樣品數(shù)（份） 所占百分比（%）3株 4 11.762株 8 23.531株 22 64.71合計(jì) 34 1003 討論3.1 這次對(duì)奉賢地區(qū)大型中央空調(diào)和部分環(huán)境的軍團(tuán)菌污染調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，中央空調(diào)冷卻塔水中的陽(yáng)性率達(dá)67.19%，遠(yuǎn)高于環(huán)境中的

13、陽(yáng)性率3.28%，證明空調(diào)冷卻水軍團(tuán)菌污染相當(dāng)嚴(yán)重。冷卻塔作為中央空調(diào)系統(tǒng)的一部分，其產(chǎn)生的循環(huán)水不僅為軍團(tuán)菌提供了理想的生存環(huán)境6 ，而且提供了傳播的形式氣溶膠。冷卻塔水被污染后，通過(guò)空調(diào)機(jī)入口和通風(fēng)管被抽入室內(nèi)或在冷卻塔一定范圍形成氣溶膠，人引吸入而被感染。空調(diào)系統(tǒng)冷卻塔污染是導(dǎo)致軍團(tuán)菌感染的主要原因之一7 ，由于軍團(tuán)菌是一類水生菌群，生存環(huán)境界限廣泛，水中存活時(shí)間較長(zhǎng)，因此水質(zhì)的跟蹤檢測(cè)及水的消毒十分重要。3.2 在此次的調(diào)查中，檢出了6種不同菌型，顯示了軍團(tuán)菌血清型呈多樣化發(fā)展的趨勢(shì)。而其中又以LP1為重點(diǎn)菌型，占檢出菌的50.85%。這與之前國(guó)內(nèi)報(bào)道的軍團(tuán)菌分布情況一致8。而且在同一

14、樣品中檢出了不同菌型，2株以上的占35.29,%，證明了在空調(diào)冷卻塔水中存在著嚴(yán)重的多重污染，再次證明奉賢地區(qū)軍團(tuán)菌污染狀況岌岌可危。由軍團(tuán)菌污染環(huán)境可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果應(yīng)該引起我們足夠的重視。3.3在軍團(tuán)菌的研究中從流行環(huán)境中檢出的菌株以空調(diào)系統(tǒng)冷卻塔水較多，而此次我們?cè)诰频甑脑∈疑徟铑^中檢出了2株軍團(tuán)菌，這屬少見，也充分說(shuō)明軍團(tuán)菌就存在我們?nèi)粘Ｉ钪?。提醒市民?duì)自己家里的淋浴器等設(shè)備也要進(jìn)行定期檢測(cè)，消毒，清除水垢，污物。軍團(tuán)菌爆發(fā)流行的可能性正日益臨近。居民小區(qū)的集中供水，加濕器，熱水器，空調(diào)器的日益普及無(wú)時(shí)不刻提醒我們衛(wèi)生管理部門急需重視這個(gè)文明病。3.4 由于軍團(tuán)菌的培養(yǎng)分離方法繁瑣，人

15、工培養(yǎng)條件的苛刻及其生長(zhǎng)代謝的緩慢導(dǎo)致標(biāo)本檢出率低下，從而造成事實(shí)上的假陰性，漏檢。檢測(cè)技術(shù)相對(duì)滯后，對(duì)于軍團(tuán)菌的預(yù)防與治療十分不利。PCR方法檢測(cè)軍團(tuán)菌完全是從細(xì)菌的基因水平入手，針對(duì)5SrRNA設(shè)計(jì)的屬特異性引物，從而比以往所有傳統(tǒng)的外顯蛋白質(zhì)表型檢測(cè)更為可靠。而運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）的高敏感性，強(qiáng)特異性和快速等特點(diǎn)，可以克服常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)的缺陷,顯著簡(jiǎn)化了操作，有利于軍團(tuán)菌防治工作的開展。而此次運(yùn)用兩種方法對(duì)軍團(tuán)菌的調(diào)查分析中也可以看到，PCR方法的陽(yáng)性檢出率要高于常規(guī)法的檢出率。3.5 軍團(tuán)菌病約90%是由嗜肺軍團(tuán)菌所致，某些軍團(tuán)菌含有的巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)基因（mip）看調(diào)控24-27KD外膜蛋白形成，這種蛋白可以使正常身強(qiáng)體壯的人患病。這使得過(guò)去認(rèn)為軍團(tuán)菌為條件致病菌的理論受到看極大沖擊，也使得這種可通過(guò)氣溶膠傳播的呼吸道傳染病變得日益恐怖。軍團(tuán)菌造成的空氣污染和水源污染正是發(fā)展中城市的一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，加強(qiáng)軍團(tuán)菌監(jiān)測(cè)，建立快速的檢測(cè)技術(shù)，努力做好防范工作是我國(guó)衛(wèi)生管理部門亟待重視和解決的問(wèn)題之一。目前，尚無(wú)軍團(tuán)菌相關(guān)疫苗，無(wú)人-認(rèn)傳播的有效證據(jù)。所以加強(qiáng)對(duì)軍團(tuán)菌重要傳染源-水系統(tǒng)的衛(wèi)生管理，是預(yù)防軍團(tuán)菌發(fā)生和流行的關(guān)鍵。參考文獻(xiàn)：1朱水榮,葉菊連,孟真,等.浙江省首次從空調(diào)冷卻塔水中分離到軍團(tuán)菌J.中華流