ECSOD在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)

1、EC-SOD在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)朱希強(qiáng)，袁勤生*（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）摘要：目的在大腸桿菌中表達(dá)可溶性EC-SOD。方法將表達(dá)質(zhì)粒EC-pet28a（+）轉(zhuǎn)入宿主菌BL21（DE3）plysS中進(jìn)行表達(dá)，在低溫下培養(yǎng)含表達(dá)質(zhì)粒EC-pet28a（+）的宿主菌BL21（DE3），通過SDS-PAGE電泳，觀察其在超聲上清中的表達(dá)。結(jié)果EC-SOD在BL21（DE3）plysS中表達(dá)，其量比在BL21（DE3）降低約20%，上清中有明顯表達(dá)；在20和15培養(yǎng)時，EC-SOD在BL21（DE3）的超聲上清中有表達(dá)。結(jié)論EC-SOD在BL21（DE3）pl

2、ysS中或在BL21（DE3）中低溫培養(yǎng)，均可實(shí)現(xiàn)部分上清中的表達(dá)。關(guān)鍵詞：EC-SOD；BL21（DE3）plysS；基因表達(dá) The resolution expression of EC-SOD in supernatant by E. coliZHU Xi-qiang, YUAN Qin-sheng（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering and Institute of Biochemistry, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, C

3、hina）Abstract:ObjectiveTo express the resolution EC-SOD by E.coli.MethodsThe expression plasmid EC-pet28a（+） was transformed into BL21（DE3）plysS and BL21（DE3）containning expression plasmid EC-pet28a（+） was cultivated in low temperature. The expression of EC-SOD in supernatant was observed by SDS-PAG

4、E. ResultsThe expressed amount of EC-SOD by BL21（DE3）plysS was less about 30% than that by BL21（DE3）, and it could express in supernatant obviously; EC-SOD could also express in supernatant by BL21（DE3）which was fermented in the temperature 20 and 15.ConclusionEC-SOD can express in supernatant by BL

5、21（DE3）plysS or by BL21（DE3） fermented in low temperature.Key words: EC-SOD; BL21（DE3）plysS; gene expression人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）是目前已知的3種SOD同工酶之一，是含Cu，Zn金屬離子的分泌型糖蛋白，主要在血管壁高效表達(dá)1, 有顯著降血糖，降血脂及降血壓作用24。EC-SOD在組織中含量極少，分離純化相當(dāng)困難，因此進(jìn)行基因克隆表達(dá)具有重要意義。我室賀華君等構(gòu)建了EC-SOD的表達(dá)質(zhì)粒，并在BL21（DE3）中進(jìn)行了表達(dá)5。表達(dá)產(chǎn)物均為包涵體。由于EC-SOD是四亞基的金屬

6、酶，每個亞基中含有6個巰基，使包涵體復(fù)性率較低。為此我們嘗試了將此基因在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)。首先，將EC-SOD在BL21（DE3）plysS中進(jìn)行表達(dá)。BL21（DE3）plysS中含有質(zhì)粒plysS，此質(zhì)?？傻退匠掷m(xù)表達(dá)T7溶菌酶，降低了T7RNA聚合酶的量，從而使重組基因的表達(dá)水平下降。另將原工程菌在低溫下培養(yǎng)，降低基因表達(dá)速度，使其有充分時間進(jìn)行正確折疊。以上措施均使EC-SOD在菌體超聲上清中獲得了表達(dá)。1材料、儀器與試劑1.1實(shí)驗(yàn)材料EC-SOD基因工程菌由本課題組構(gòu)建；質(zhì)粒Pet-28a（）和菌株BL21（DE3）由中科院上海生物化學(xué)研究所吳祥甫教授提供；菌株BL21（D

7、E3）plysS由本校張慧展教授的實(shí)驗(yàn)室提供；種子培養(yǎng)基用LB培養(yǎng)基。1.2儀器及試劑高速冷凍離心機(jī)（BIOFUGE-28RS，德國），超聲波細(xì)粉破碎機(jī)（JY92-，寧波新芝科學(xué)儀器研究所），回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶培養(yǎng)柜（HYG-，上海新蕊自動化設(shè)備有限公司）,紫外分光光度計（UV-2100，UNICO），電泳槽（HOEFER,美國），硫酸卡那霉素（Kana, ultra pure grade，750mcg/mg,Amresco分裝，怡成生物公司），氯霉素（Cm, ultra pure grade，Amresco分裝，怡成生物公司），異丙-D-硫代半乳糖苷IPTG（ultra pure grade

8、,Calbiochem分裝，怡成生物公司），胰蛋白胨和酵母提取物（ Oxoid Ltd, England）,連苯三酚（E.Merk，BP），丙烯酰胺（進(jìn)口分裝，上海源聚生物科技有限公司），N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（Fluka公司），其它均為國產(chǎn)分析純試劑。2方法2.1表達(dá)質(zhì)粒EC-PET28a（+）轉(zhuǎn)化BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增取2L質(zhì)粒（約100ng），加入90L感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后，涂布含20mg/mL 氯霉素（Cm）和50mg/ mL硫酸卡那霉素（Kana）的LB固體平板。37倒置培養(yǎng). 挑取單菌落, 在含20mg/ mL Cm和50mg/ mL Kana的LB固體

9、平板上劃線擴(kuò)增。2.2轉(zhuǎn)化子雙質(zhì)?？斐殍b定 用牙簽蘸取少量劃線擴(kuò)增的菌體，依法進(jìn)行質(zhì)?？斐?。取5L質(zhì)粒溶液，用Hind酶切鑒定，同時以plysS和EC-pet28a（+）做對照。2.3EC-SOD在BL21（DE3）和在BL21（DE3）pLysS中表達(dá)量的比較取含表達(dá)質(zhì)粒的BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS甘油種各50L, 分別接種于30mL含50mg/mLKana 及20mg/mLCm和50mg/mLKana的LB培養(yǎng)液中，37條件下培養(yǎng)過夜。按1%接種量翻二級LB瓶,抗生素種類和濃度同上。約2h后,波長600nm處測吸光度A值，當(dāng)A達(dá)到0.40.6時，加1.0mmol/LI

10、PTG誘導(dǎo)，取同量菌體，處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳6。2.4EC-SOD在BL21（DE3）pLys超聲上清中的可溶性表達(dá)按以上方法培養(yǎng)菌體，誘導(dǎo)4h后收集菌體。加Triton-EDTA緩沖液5mL，混勻后超聲，功率為300W,時間5s,間隔5s,共超聲90次。10000r/min離心10min，收集上清，加2 SDS緩沖液，沸水中煮沸10min，15000r/min離心10min，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳。2.5培養(yǎng)溫度對EC-SOD在BL21（DE3）中表達(dá)量的影響37條件下LB搖瓶同時培養(yǎng)4瓶菌體，每瓶體積均為30mL當(dāng)A600nm為0.40.6時，分別用1mmol/L IPT

11、G誘導(dǎo)，然后分別置30，25，20及15條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為5，10，20及35h, 收集不同溫度培養(yǎng)下的相同菌體離心后加1 SDS緩沖液，沸水中煮沸10min，15000r/min離心10min，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳。2.6EC-SOD在BL21（DE3）中的可溶性表達(dá)培養(yǎng)條件同上。收集不同溫度培養(yǎng)下的菌體，加入含溶菌酶（0.1mg/mL）的Triton-EDTA緩沖液4mL，超聲破碎菌體，超聲功率為500W，時間為5s，間隔5s。共超聲100次。離心后收集上清，加2 SDS緩沖液，沸水中煮沸10min，15000r/min離心10min，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳。3結(jié)

12、果3.1轉(zhuǎn)化子雙質(zhì)?？斐殍b定結(jié)果見圖1。轉(zhuǎn)化子中所含的質(zhì)粒經(jīng)Hind酶切后，產(chǎn)生3個大小不同的片段，其大小與質(zhì)粒plysS和EC-pet28a（+）單獨(dú)用Hind酶切產(chǎn)生的片段相對應(yīng)，說明該轉(zhuǎn)化子中除含有質(zhì)粒EC-pet-28（+）外，還含有plysS質(zhì)粒，圖1轉(zhuǎn)化子雙質(zhì)?？斐殍b定1.plysS酶切后；2. EC-pet-28a（+）酶切后；3.DNA marker；4.轉(zhuǎn)化子雙質(zhì)粒酶切3.2EC-SOD在BL21（DE3）和在BL21（DE3）plysS中表達(dá)量的比較SDS-PAGE分析結(jié)果表明，hEC-SOD在BL21（DE3）plysS及BL21（DE3）中均可以表達(dá)，經(jīng)掃描分析，顯示相

13、同量菌體中目的蛋白在前者中的表達(dá)量比后者降低了約20%，說明質(zhì)粒plysS起到了降低蛋白表達(dá)量的作用，結(jié)果見圖2。3.3EC-SOD在BL21（DE3）plys超聲上清中的可溶性表達(dá)SDS-PAGE分析結(jié)果表明，hEC-SOD在BL21（DE3）的超聲上清中沒有表達(dá)，在BL21（DE3）plysS菌體超聲上清中有少量表達(dá)，但大部分仍以包涵體形式存于沉淀中，結(jié)果見圖3。圖3EC-SOD在BL21（DE3）plys超聲上清中的可溶性表達(dá)1.EC-SOD在BL21（DE3）中的表達(dá)超聲上清；2.標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker；3. EC-SOD在BL21（DE3）plys超聲上清中的可溶性表達(dá)；4. EC-S

14、OD在BL21（DE3）plys超聲沉淀中的包涵體表達(dá)3.4培養(yǎng)溫度對EC-SOD在BL21（DE3）中表達(dá)量的影響結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)溫度降低，EC-SOD表達(dá)量明顯降低，結(jié)果見圖4。在20培養(yǎng)時，表達(dá)條帶清晰可見，15時表達(dá)量已經(jīng)很少。圖4不同細(xì)胞培養(yǎng)溫度對蛋白的影響1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker；2.30培養(yǎng)時的表達(dá)；3. 25培養(yǎng)時的表達(dá)；4. 20培養(yǎng)時的表達(dá)；5. 15培養(yǎng)時的表達(dá)3.5EC-SOD在BL21（DE3）中的可溶性表達(dá)結(jié)果表明，菌體在20培養(yǎng)時，超聲上清中開始有EC-SOD少量表達(dá)，15培養(yǎng)時，超聲上清中EC-SOD表達(dá)較明顯，但表達(dá)量不大。結(jié)果見圖5。圖5EC-SOD在B

15、L21（DE3）中的可溶性表達(dá)1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker；2. 30培養(yǎng)時的超聲上清；3. 25培養(yǎng)時的超聲上清；4.20培養(yǎng)時的超聲上清；5.15培養(yǎng)時的超聲上清4討論重組基因在大腸桿菌中經(jīng)常是以包涵體形式表達(dá)的，其主要原因是基因表達(dá)量太高，來不及進(jìn)行正確折疊，此外，大腸桿菌中缺乏外援基因正確折疊系統(tǒng)，使基因的正確折疊更加困難。雖然包涵體可減少分離純化的麻煩，但對某些基因來講，包涵體的體外復(fù)性率較低，因此要得到足夠量的折疊正確的蛋白質(zhì)是十分困難的。在真核中表達(dá)目的基因可得到有活性的蛋白，但相對大腸桿菌而言，真核細(xì)胞培養(yǎng)本身成本較高，因此，探討外源基因在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)具有重要意義。實(shí)現(xiàn)基

16、因在大腸桿菌超聲上清中的可溶性表達(dá)，最常用的方法就是改變細(xì)胞培養(yǎng)條件，如溫度和pH等，使細(xì)胞生長速度減慢，生長周期延長，相應(yīng)的使基因表達(dá)時間延長，使其有足夠的時間進(jìn)行正確折疊。改變培養(yǎng)條件還可以影響蛋白合成酶的活性，從而降低蛋白質(zhì)的合成量。本實(shí)驗(yàn)中，采用降低溫度的辦法，表明隨著溫度降低，相同菌體外源基因的表達(dá)量明顯下降。對超聲上清進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明，菌體在20培養(yǎng)時，超聲上清中開始EC-SOD少量表達(dá)，15培養(yǎng)時，超聲上清中EC-SOD表達(dá)較明顯，但表達(dá)量不大。實(shí)驗(yàn)還表明，在超聲沉淀中，仍存有大量的外源基因的包涵體。PlysS質(zhì)粒對基因表達(dá)量的降低是十分明顯的，而且整個過程中不影響

17、細(xì)菌的生長，在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基因的可溶性表達(dá)，因此比降低溫度的方法更有效。在BL21（DE3）plys中表達(dá)時，因?yàn)楹p質(zhì)粒，操作相對較麻煩，而且表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）plys時轉(zhuǎn)化率相對較低。參考文獻(xiàn)1Oury T D, Chang L Y, Markloud S L, et al. Immunocytochemical localization of extracellular superoxide dismutase in human lungJ. Lab Invest, 1994，70：889-898.2Adachi T, Ohta H, Hirano K, et al. No

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