測定糖化酶活性的方法

1、糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶,糖化酶是一種習(xí)慣上的名稱，學(xué)名為-1,4-葡萄糖水解酶(-1,4-Glucan glucohydrolace)。多應(yīng)用于酒精、淀粉糖、味精、抗菌素、檸檬酸、啤酒等工業(yè)以及白酒、黃酒。糖化酶是由曲霉優(yōu)良菌種（Aspergilusniger）經(jīng)深層發(fā)酵提煉而成。糖化酶是食品工業(yè)中常用的一種酶。 糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端（整個(gè)碳鏈只有一個(gè)還原端，與之相對的都是非還原端）依次水解a- 1,4 糖苷鍵, 切下一個(gè)個(gè)葡萄糖單元，并像- 淀粉酶一樣, 使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化，形成- D- 葡

2、萄糖。對于支鏈淀粉，當(dāng)遇到分支點(diǎn)時(shí)，它也可以水解a- 1,6 糖苷鍵，由此將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 連接的碳鏈，但水解a- 1,4 糖苷鍵的速度最快，它一般都能將淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。酶活測定方法酶活測定方法 測定糖化酶的方法有次碘酸鈉法、蘭愛農(nóng)法（法） 、Schoorl法（法）和對硝基苯酚葡萄糖法（法）、3,5-二硝基水楊酸(DNS) 等方法。 我們采用次碘酸鈉法來測定糖化酶的活性。糖化酶以可溶性淀粉為底物在一定條件下（pH范圍是46, 溫度范圍是4060）進(jìn)行反應(yīng)，生成的葡萄糖用次碘酸鈉法定量測定。以單位時(shí)間內(nèi)分解，糖苷鍵生成葡萄糖所需的酶量為酶的

3、活力單位。次碘酸鈉法： 碘與NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性條件下，未與C6H12O6 作用的NaIO可轉(zhuǎn)變成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的I2 ，便可計(jì)算出未參與反應(yīng)的NaIO ，由此推導(dǎo)出糖化酶催化所產(chǎn)生的C6H12O6 的含量。具體步驟 1.I2 與 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2.C6H12O6 與NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI3. C6H12O6反應(yīng)完后,剩余的NaIO在堿性條件下發(fā)生歧化反應(yīng): 3 NaIO=NaIO3 +2 Na

4、I4.歧化產(chǎn)物在酸性條件下進(jìn)一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O5.析出的I2 可用標(biāo)準(zhǔn)Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI注：在這一系列的反應(yīng)中，1mol葡萄糖與1mol NaIO作用，而1molI2產(chǎn)生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖與1molI2 相當(dāng)。只要得出對照組和實(shí)驗(yàn)組所消耗的硫代硫酸鈉體積，兩者相減就可以得出與葡萄糖反應(yīng)的那部分次碘酸鈉的量，從而可以確定酶解生成的葡萄糖的量，從而計(jì)算出酶活。 對照組 實(shí)驗(yàn)組試劑與器材1.糖化酶試劑；2.微量滴定管、滴定臺、試劑瓶、試管、

5、三角瓶、pH計(jì)、電子天平；3.試劑 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸緩沖液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氫氧化鈉溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸鈉溶液；0.5%淀粉指示劑。操作步驟1. 取7個(gè)帶塞的試管（其中3個(gè)測今年批次的酶活、另外3個(gè)測去年批次的酶活、1個(gè)作空白對照），分別吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸緩沖液2.5ml，混勻后于40 水浴中預(yù)熱10min。2. 加入酶液0.5ml（空白對照組以煮沸失活的酶液代替）于40 ，反應(yīng)10min；反應(yīng)結(jié)束時(shí)，立即于沸水浴加熱5min使酶失活(此時(shí)應(yīng)將試管的塞子打開）。3.取上述反應(yīng)液

6、5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，緩慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意:加堿速度不能過快,否則過量NaIO 來不及氧化C6H12O6 而歧化為不與C6H12O6反應(yīng)的NaIO3 和NaI ,使測定結(jié)果偏低) ，搖勻后在暗處放置15min后加入2mol/L硫酸2ml；4.以0.5%可溶性淀粉為指示劑（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸鈉溶液滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。記錄0.1N硫代硫酸鈉消耗的毫升數(shù)：酶液樣品（A）、空白對照（B）；計(jì)算計(jì)算(1)在上述條件下，1ml酶液每小時(shí)催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位：酶活力單位（U/ml）=（BA）（N/2

7、） 180.1（8/5）2（60/10） 式中式中: B空白滴定消耗的硫代硫酸鈉毫升（ml）數(shù)； A酶液滴定消耗的硫代硫酸鈉毫升（ml）數(shù)（取3次滴定的平均值）； N硫代硫酸鈉的當(dāng)量濃度。 180.1葡萄糖的摩爾質(zhì)量。 8/5表示從8ml酶反應(yīng)體系取出5ml反應(yīng)液。 2所加酶液為0.5ml，按定義為1ml。 60/10表示酶反應(yīng)時(shí)間為10min，按定義為1h。（2）在上述條件下， 1ml酶液每分鐘催化2%淀粉溶液水解生成1mol葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）：酶活力單位（U/ml）=（BA）10-3 （N/2）（8/5）1062 （1/10）式中符號與前式相同，其中： 10-3 ml換

8、算成L。 106 mol換算成mol。反應(yīng)試劑配制方法反應(yīng)試劑配制方法（1）2%可溶性淀粉 稱取可溶性淀粉2g（預(yù)先100烘干約2h至恒重），用少量蒸餾水調(diào)勻，徐徐傾入巳沸的蒸餾水中，煮沸至透明，冷卻定容至l00ml，此溶液需當(dāng)天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6 醋酸鈉緩沖液 稱取醋酸鈉(CH3COONa3H2O)2.722g，用蒸餾水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分別取醋酸鈉49ml和醋酸51ml混勻。緩沖液以酸度計(jì)或精密試紙校正pH。 （3）0.1mol/L碘液 稱取13g碘及35g碘化鉀，溶于100mL水中，稀釋定容至1000mL，搖勻，貯存于棕色瓶中。 （4）0.1mo1/L氫氧化鈉溶液 稱取4g氫氧化鈉加蒸餾水溶解，定容至1000ml。 （5）2mol/L硫酸溶液 量取濃硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸餾水中，冷卻后定容至l00ml，搖勻。 （ 6）0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液 配制：稱取結(jié)晶硫代硫酸鈉(Na2S2O35H2O) 24.82g和碳酸鈉約0.2g（硫代硫酸鈉溶液在pH9-10時(shí)最穩(wěn)定）溶于煮