芒果苷對缺氧損傷骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的保護(hù)

1、芒果苷對缺氧損傷骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的保護(hù)*李曉峰1，羅世興2，趙勁民1，程建文1，譚 楨1(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科，廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)第九附屬醫(yī)院暨北海市人民醫(yī)院骨科，廣西壯族自治區(qū)北海市 536000)文章亮點(diǎn)：1 實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用芒果苷干預(yù)缺氧損傷的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以減少細(xì)胞凋亡。結(jié)果證實(shí)芒果苷具有保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的作用，其效應(yīng)呈濃度依賴性。2 實(shí)驗(yàn)的不足之處在于未對芒果苷保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的機(jī)制進(jìn)行深入的分析。關(guān)鍵詞：干細(xì)胞；骨髓干細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；缺氧；凋亡；芒果苷；氯化鈷；省級基金；干細(xì)胞圖片文章主題詞：干

2、細(xì)胞；間質(zhì)干細(xì)胞；缺氧；細(xì)胞凋亡；膜電位；線粒體基金資助：廣西衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)(GZKZ 10-011)*；廣西研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目(2D26)*；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(02)*；廣西科技廳人口健康與食品安全關(guān)鍵技術(shù)研究開發(fā)項(xiàng)目(桂科攻 1140003A-31)*；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(Z2012059)*；廣西教育廳立項(xiàng)項(xiàng)目(桂教201010LX050)*摘要背景：缺氧性死亡限制了細(xì)胞移植和組織再生中細(xì)胞的應(yīng)用。目的：觀察芒果苷對氯化鈷作用下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷性凋亡的保護(hù)作用。方法：體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用氯化鈷建立細(xì)胞缺氧模型，以芒果苷對缺氧損傷下

3、的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用；采用流式細(xì)胞儀檢測芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧保護(hù)的細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位檢測結(jié)果。結(jié)果與結(jié)論：氯化鈷能顯著抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長，并且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。氯化鈷200 mol/L處理細(xì)胞12 h，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率為(42.49±3.96)%；處理細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率為(46.37±4.49)%，隨著芒果苷濃度的增加，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的凋亡率逐步減少(P < 0.01)，芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷具有保護(hù)作用，且呈濃度依賴性。結(jié)果提示

4、，氯化鈷缺氧模型能成功誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，具有劑量準(zhǔn)確可控、無特殊設(shè)備要求、易操作等優(yōu)點(diǎn)；芒果苷能有效抑制缺氧損傷時骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡，對細(xì)胞具有保護(hù)作用。Mangiferin protects bone marrow-derived mesenchymal stem cells againsthypoxia-induced apoptosis Li Xiao-feng1, Luo Shi-xing2, Zhao Jin-min1, Cheng Jian-wen1, Tan Zhen1 (1Department of Traumatic Orthopaedics and Hand

5、 Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedics, Ninth Hospital (Beihai Peoples Hospital), Guangxi Medical University, Nanning 536000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China)李曉峰，男，1974年生，吉林省德惠縣人，漢

6、族，2011年廣西醫(yī)科大學(xué)畢業(yè)，博士，主治醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷外科手外科、組織工程研究。通訊作者：趙勁民，博士，教授，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科，廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021中圖分類號:R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:2095-4344(2013)49-08481-07修回日期：2013-09-14(/G·A)Li Xiao-feng, M.D., Attending physician, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital of Guan

7、gxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Corresponding author: Zhao Jin-min, M.D., Professor, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

8、 Accepted: 2013-09-14AbstractBACKGROUND: Hypoxic death limits application of cells in transplantation and tissue regeneration. OBJECTIVE: To investigate the protective effects of mangiferin on bone marrow-derived mesenchymal stem cells against hypoxia injury-induced apoptosis resulted from cobalt ch

9、loride.METHODS: Rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells were in vitro cultured and hypoxia cell model was established by cobalt chloride. Model cells were treated with mangiferin. Protective effects of mangiferin were detected using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

10、; cell apoptosis and mitochondrial membrane potential were detected using flow cytometry. RESULTS AND CONCLUSION: Cobalt chloride significantly inhibited growth of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a dose-dependent manner. The apoptosis rate of cells was (42.49±3.96)% after treated

11、with 200 mol/L cobalt chloride for 12 hours, (46.37±4.49)% after treated for 24 hours. With increasing concentration of mangiferin, apoptosis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in hypoxic model was gradually reduced (P < 0.01), indicating that mangiferin has a protective effect in

12、 a concentration-dependent manner on rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells in hypoxic injury. Cobalt chloride can induce hypoxic model successfully in bone marrow-derived mesenchymal stem cells. There are some advantages of accurate dose control, no special equipment requirements, and easy

13、operation. Mangiferin can effectively inhibit bone marrow-derived mesenchymal stem cells apoptosis under hypoxic injury.Subject headings: stem cells; mesenchymal stem cells; hypoxia; apoptosis; membrane potentials; mitochondriaFunding: the Science and Technology Program for Traditional Chinese Medic

14、ine, Department of Health of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. GZKZ 10-011*; Post-graduate Education Innovation Program of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2D26*; the Scientific Research Foundation for Doctors of High Institutes, No. 02*; the Development Program for the Key Technology of Po

15、pulation Health and Food Safety, Department of Science and Technology, Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 1140003A-31*; the Scientific Research Program of Self-provided Funds of Department of Science and Technology, Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. Z2012059*; the Program from the Department

16、of Education of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 201010LX050*Li XF, Luo SX, Zhao JM, Cheng JW, Tan Z. Mangiferin protects bone marrow-derived mesenchymal stem cells against hypoxia-induced apoptosis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(49):8481-8487. 0 引言 Introduction骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是具有多向分化潛能的成體干細(xì)

17、胞，逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)測、免疫調(diào)節(jié)和體外培養(yǎng)易擴(kuò)增等特點(diǎn)，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞治療方面特別有應(yīng)用前景。然而，移植細(xì)胞的死亡限制了組織再生。移植入器官的干細(xì)胞死亡主要機(jī)制之一由缺氧/局部缺血引起。應(yīng)用芒果苷保護(hù)缺氧損傷的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察芒果苷對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧的保護(hù)作用，為組織工程干細(xì)胞移植提高細(xì)胞存活率提供理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。1 材料和方法 Materials and methods設(shè)計(jì)：細(xì)胞生物學(xué)對比觀察實(shí)驗(yàn)。時間及地點(diǎn)：于2010年7月至2011年9月在廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。材料：取SPF級4周齡SD大鼠，雄性，

18、由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號: SCXK(桂) 2009-0002。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相關(guān)動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷凋亡保護(hù)實(shí)驗(yàn)的主要試劑與儀器：試劑及儀器L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、芒果苷、氯化鈷、MTT 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒 SW-CJ型生物潔凈工作臺 CO2培養(yǎng)箱 倒置相差顯微鏡 流式細(xì)胞儀 Multiskan MK3酶標(biāo)儀 來源GibcoSigmaBecton, Dickinson and

19、 Company南京凱基生物蘇凈集團(tuán)安泰公司ShellabOlympusBecton,Dickinson and CompanyThermo公司方法：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇全身浸泡消毒10 min。無菌條件取股骨及脛骨，PBS清洗3次。剪掉股骨和脛骨的骨骺端，用添加青、鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，反復(fù)吹打并制成單細(xì)胞懸液，離心，棄上清，重懸以1×109 L-1的細(xì)胞濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記；體外定向誘導(dǎo)分化

20、成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞。具體操作及結(jié)果參見作者前期研究1。氯化鈷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：96孔板中間10列各孔中加入第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液200 L，每孔含1×104/孔，第1列和第12列加培養(yǎng)基200 L。培養(yǎng)箱中溫育24 h。第2列和第11列作為正常對照。按濃度梯度在第3-10列加入含氯化鈷的無血清培養(yǎng)基孵育24 h(加入濃度依次為0，50，100，200，400，600，800，1 000 mol/L)。棄培養(yǎng)基，各孔更換200 L新鮮的培養(yǎng)基。每日換液至48 h。所有孔中各加入50 L MTT，并用鋁箔包裹培養(yǎng)板，于CO2培養(yǎng)箱中溫育4 h。棄培養(yǎng)基和M

21、TT，所有孔中各加入200 L DMSO。492 nm處記錄吸光度值(A)。讀板儀用第1列的各孔調(diào)零。分析以藥物濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，A值為縱坐標(biāo)(Y軸)繪制曲線圖。芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)的MTT實(shí)驗(yàn)：96孔板中間十列各孔中加入第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液200 L，1×104/孔，第1列和第12列加培養(yǎng)基200 L。CO2培養(yǎng)箱中溫育24 h。芒果苷預(yù)保護(hù)：按濃度梯度在第2-11列加入芒果苷孵育2 h (濃度依次為10，20，30，40，50，60，80，120，160，200 mol/L)。 吸去2-11列的培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入含氯化鈷200 mol/

22、L的無血清培養(yǎng)基200 L，并按上述濃度梯度加入芒果苷。CO2培養(yǎng)箱中溫育24 h。換新鮮培養(yǎng)基并每日換液至48 h。所有孔中各加入50 L MTT。鋁箔包裹培養(yǎng)板，CO2培養(yǎng)箱中溫育4 h。棄培養(yǎng)基和MTT，所有孔中各加入200 L DMSO。在492 nm處記錄A值。讀板儀用第1列的各孔調(diào)零。分析以藥物濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，A值為縱坐標(biāo)(Y軸)繪制曲線圖。芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)的細(xì)胞凋亡檢測：取第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5×105/孔接種6孔板，飽和濕度下37 ，含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。芒果苷預(yù)保護(hù)：按濃度梯度加入芒果苷孵育2 h(濃度依次

23、為20，40，80，160 mol/L)。棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，加入含200 mol/L氯化鈷的無血清培養(yǎng)基，再次加入芒果苷，再次加入上述濃度芒果苷，同時設(shè)立正常細(xì)胞對照組、無血清組、200 mol/L氯化鈷組，培養(yǎng)12 h及24 h。消化，收集細(xì)胞。按試劑盒操作并流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)的線粒體膜電位檢測：取第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5×105/孔接種6孔板，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。芒果苷預(yù)保護(hù)：按濃度梯度加入芒果苷孵育2 h(濃度依次為20，40，80，160 mol/L)。棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，加入含200 mol/L

24、氯化鈷的無血清培養(yǎng)基，再次加入上述濃度芒果苷，同時設(shè)立正常細(xì)胞組、無血清組、200 mol/L氯化鈷組，培養(yǎng)12 h及24 h。消化，收集細(xì)胞。按試劑盒操作并流式細(xì)胞儀進(jìn)行線粒體膜電位檢測分析。主要觀察指標(biāo)：氯化鈷對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的細(xì)胞毒性。芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果。芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧保護(hù)的細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果。芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)的線粒體膜電位檢測結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：由第一作者應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LCD法；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用

25、秩和檢驗(yàn)；P < 0.05為差異有顯著性意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)重復(fù)3次。 2 結(jié)果 Results2.1 氯化鈷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的細(xì)胞毒性 MTT法證實(shí)，氯化鈷能顯著抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長，并且呈明顯的劑量依賴關(guān)系，見圖1和表1。其中氯化鈷200 mol/L處理24 h與正常細(xì)胞組的A值比值為53.41%，抑制率即為53.41%，接近IC50，確定為以后實(shí)驗(yàn)濃度作用組。圖1 氯化鈷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的細(xì)胞毒性Figure 1 Cytotoxicity test of cobalt chloride on rat bone marrow-derived mes

26、enchymal stem cells0.70.60.50.40.30.20.10A 492 nm1：正常細(xì)胞組；2：無血清組；3：氯化鈷50 mol/L組；4：氯化鈷100 mol/L組；5：氯化鈷200 mol/L組；6：氯化鈷400 mol/L組；7：氯化鈷600 mol/L組；8：氯化鈷800 mol/L組；9：氯化鈷1 000 mol/L組1 2 3 4 5 6 7 8 9 注：氯化鈷能顯著抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長，并且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。表1 不同濃度氯化鈷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞毒性的比較 Table 1 Cytotoxicity test of cobalt chlo

27、ride at different concentrations on rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (±s, n= 8, A492 nm)注：氯化鈷能顯著抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長，并且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。組別 ±s正常細(xì)胞組0.558±0.041無血清組0.487±0.038氯化鈷50 mol/L組0.367±0.031氯化鈷100 mol/L組0.347±0.024氯化鈷200 mol/L組0.298±0.021氯化鈷400 mol/L組0.182&

28、#177;0.013氯化鈷600 mol/L組0.126±0.011氯化鈷800 mol/L組0.035±0.003氯化鈷1 000 mol/L組0.005±0.001F37.46P< 0.052.2 芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，芒果苷能顯著保護(hù)缺氧損傷的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并且呈明顯地時間和劑量依賴關(guān)系，見表2。氯化鈷處理細(xì)胞12 h，芒果苷20 mol/L組與單純氯化鈷200 mol/L組的保護(hù)作用差異有顯著性意義(P < 0.05)；隨著芒果苷濃度的升高，芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸增

29、強(qiáng)，差異有非常顯著性意義(P < 0.01)。用氯化鈷處理細(xì)胞24 h，隨著芒果苷濃度的升高，芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，差異有非常顯著性意義(P < 0.01)。組別 12 h 24 h氯化鈷200 mol/L組 0.061±0.004 3 0.062±0.003 7氯化鈷200 mol/L + 芒果苷10 mol/L組0.064±0.003 9 0.072±0.003 4b氯化鈷200 mol/L + 芒果苷20 mol/L組 0.072±0.004 6a 0.079±0.004 1b氯化鈷200

30、mol/L + 芒果苷30 mol/L組 0.082±0.005 1b 0.083±0.004 5b氯化鈷200 mol/L + 芒果苷40 mol/L組 0.099±0.006 7b 0.088±0.004 6b氯化鈷200 mol/L + 芒果苷60 mol/L 組 0.112±0.007 4b 0.099±0.005 1b氯化鈷200 mol/L +芒果苷80 mol/L組 0.131±0.008 2b 0.107±0.004 9b氯化鈷200 mol/L + 芒果苷100 mol/L組 0.158±

31、;0.009 6b 0.111±0.005 3b氯化鈷200 mol/L + 芒果苷200 mol/L組 0.177±0.013 7b 0.121±0.006 2bF33.47 26.14P0.05-0.01 < 0.01表2 不同濃度芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)的MTT檢測結(jié)果比較 Table 2 MTT assay of protective effects of mangiferin on rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (±s, n=8, A492 nm)與氯化鈷20

32、0 mol/L組相比，aP < 0.05，bP < 0.01，注：提示芒果苷能顯著保護(hù)缺氧損傷的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并且呈明顯地時間和劑量依賴關(guān)系。2.3 芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧保護(hù)的細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果 芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用呈時間及濃度依賴性，見表3及圖2。表3 不同濃度芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷凋亡的保護(hù)作用比較 Table 3 Protective effects of mangiferin at different concentrations on bone marrow-derived mesenchymal stem ce

33、lls against hypoxia-induced apoptosis (±s, n=3, %)組別12 h凋亡率24 h凋亡率正常對照組 4.75±0.34b5.02±0.37b無血清組 9.47±0.87b10.15±0.93b氯化鈷200 mol/L組 42.49±3.9646.37±4.49氯化鈷200 mol/L+芒果苷20 mol/L組 39.78±4.1542.69±4.12a氯化鈷200mol/L+芒果苷40 mol/L組 34.72±3.68a38.85±3.85

34、b氯化鈷200 mol/L+芒果苷80 mol/L組 25.97±2.79b33.19±3.01b氯化鈷200 mol/L+芒果苷160 mol/L 組 23.83±2.45b27.58±3.44bF 28.9725.39P < 0.05-0.01< 0.05-0.01與氯化鈷200 mol/L組相比，aP < 0.05，bP < 0.01。注：提示芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用呈時間依賴性及濃度依賴性。 B：無血清培養(yǎng)細(xì)胞，凋亡率9.52%A：正常細(xì)胞，凋亡率3.06%D：氯化鈷200 mol/L作用24 h，凋

35、亡率47.24%C：氯化鈷200 mol/L作用12 h，凋亡率41.21%F：氯化鈷200 mol/L+芒果苷40 mol/L作用24 h，凋亡率38.85%E：氯化鈷200 mol/L+芒果苷40 mol/L作用12 h，凋亡率31.4%注：芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用呈時間依賴性及濃度依賴性。圖2 芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧保護(hù)的細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果Figure 2 Apoptosis rate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells treated with mangiferin 用氯化鈷200 mol/L處理細(xì)

36、胞12 h，誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡率為(42.49±3.96)%。芒果苷20 mol/L組無明顯保護(hù)作用，芒果苷40 mol/L組有顯著保護(hù)作用(P < 0.05)；隨著芒果苷濃度的升高，芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，差異有非常顯著性意義(P < 0.01)。用氯化鈷200 mol/L處理細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡率為(46.37±4.49)%，芒果苷20 mol/L組有顯著保護(hù)作用(P < 0.05)，隨著芒果苷濃度的升高，芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，差異有非常顯著性意義(P < 0.01

37、)。2.4 芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)的線粒體膜電位檢測結(jié)果 見表4及圖3。組別12 h凋亡率24 h凋亡率正常對照組 5.25±0.41b 5.36±0.49b無血清組 9.79±0.73b 11.22±0.81b氯化鈷200 mol/L組 35.60±3.18 42.57±4.30氯化鈷200 mol/L+芒果苷20 mol/L組 31.39±3.98 38.92±4.57a氯化鈷200mol/L+芒果苷40 mol/L組 26.18±3.51a 38.85±3.85b氯化鈷2

38、00 mol/L+芒果苷80 mol/L組 23.17±2.44b 26.77±3.40b氯化鈷200 mol/L+芒果苷160 mol/L組 20.69±2.29b 23.19±3.06bF 34.1629.79P < 0.05-0.01< 0.05-0.01表4 芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)的線粒體膜電位檢測結(jié)果 Table 4 Mitochondrial membrane potential detection of bone marrow-derived mesenchymal stem cells treated wit

39、h mangiferin (±s, n=3, %)與氯化鈷200 mol/L組相比，aP < 0.05，bP < 0.01。注：提示芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的線粒體膜電位保護(hù)作用呈時間依賴性及濃度依賴性。 A：氯化鈷200 mol/L作用12 h，凋亡率 35.60%B：氯化鈷200 mol/L+芒果苷40 mol/L，作用12 h，凋亡率 26.37%C：氯化鈷200 mol/L作用24 h，凋亡率 42.65%D：氯化鈷200 mol/L+芒果苷40 mol/L，作用24 h，凋亡率 32.96%注：芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的線粒體膜電位保護(hù)作

40、用呈時間依賴性及濃度依賴性。 圖3 芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧保護(hù)的線粒體膜電位檢測結(jié)果Figure 3 Mitochondrial membrane potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells treated with mangiferin芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷的線粒體膜電位保護(hù)作用呈時間依賴性及濃度依賴性。用氯化鈷200 mol/L處理細(xì)胞12 h，誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電位凋亡率為(35.60±3.18)%。芒果苷20 mol/L組無明顯保護(hù)作用，芒果苷40 mol/L組有顯著的保護(hù)作用(P &l

41、t; 0.05)；隨著芒果苷濃度的升高，芒果苷的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，差異有非常顯著性意義(P < 0.01)。用氯化鈷200 mol/L處理細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)凋亡率為(42.57± 4.30)%，芒果苷20 mol/L組有顯著保護(hù)作用(P < 0.05)，隨著芒果苷濃度的升高，芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，差異有非常顯著性意義(P < 0.01)。3 討論 Discussion骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在骨髓中具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，能分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及肝細(xì)胞等2-4。李曉峰等1應(yīng)用全骨髓貼壁

42、法獲得了高純度、增殖能力強(qiáng)、數(shù)量足的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植已經(jīng)證實(shí)有效地治療心肌梗死、下肢缺血、急性腎功能衰竭和肝移植5-6。然而，移植細(xì)胞的死亡限制了組織再生。移植入器官的干細(xì)胞死亡主要機(jī)制之一由缺血引起。有研究表明在移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至缺血心肌4 d后，99%的細(xì)胞死亡7。周美玲等8發(fā)現(xiàn)低氧條件下預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能增強(qiáng)對心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)效應(yīng)。細(xì)胞缺氧損傷模型的建立對于研究細(xì)胞缺血損傷機(jī)制、缺血適應(yīng)變化及藥物缺氧保護(hù)機(jī)制等意義重大。目前，細(xì)胞缺氧模型一般有兩類：物理性缺氧復(fù)氧模型和化學(xué)性細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型。物理性缺氧復(fù)氧模型中常用方法有氮?dú)怙柡头?、液體石蠟覆蓋法、

43、低糖培養(yǎng)法等多種方法9-11。然而，使用物理性模型很難達(dá)到比較理想的缺氧模擬效果，其特異性不高，且操作相對復(fù)雜，費(fèi)用較高，設(shè)備要求高，耗時較長。因此，不利于實(shí)驗(yàn)條件的精確調(diào)控。化學(xué)細(xì)胞缺氧模型最常見的是應(yīng)用連二亞硫酸鈉和氯化鈷等造模方法12-13。應(yīng)用連二亞硫酸鈉不易確定藥物最佳作用濃度，缺氧時間不易控制，復(fù)氧后化學(xué)藥物殘留可對細(xì)胞有持續(xù)損傷作用。文章以氯化鈷構(gòu)建大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)模型，利用正常氧條件下，Co2+通過細(xì)胞內(nèi)離子置換使亞鐵螯合酶失活，抑制細(xì)胞氧化反應(yīng)，從而達(dá)到模擬細(xì)胞缺氧的目的。氯化鈷缺氧模型具有劑量準(zhǔn)確可控、無特殊設(shè)備要求、易操作等優(yōu)點(diǎn)，是一種比較好的化學(xué)缺氧誘導(dǎo)劑1

44、4。缺氧，會引起細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，對細(xì)胞產(chǎn)生損害15。應(yīng)用抗氧化劑能清除自由基，減輕氧化應(yīng)激帶來的細(xì)胞損害16-17?？寡趸瘎┩ǔＪ沁€原劑，包括：自由基吸收劑18-19：如酚類抗氧化劑、維生素E、類胡蘿卜素。氧清除劑20：如抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、異抗壞血酸和異抗壞血酸鈉等。金屬離子螯合劑：枸櫞酸、EDTA和磷酸衍生物21-22。體內(nèi)還有谷胱甘肽、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等酶，以及各種過氧化酶減輕氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷23-25。芒果甙是一種四羥基吡啶的碳糖甙，屬雙苯吡酮類化合物。現(xiàn)代藥理和臨床研究證明，芒果甙以及含芒果甙植物提取物具有多方面生理和藥理作用，如抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)凋亡、抗炎

45、癥、抗癌、抗糖尿病等作用26-31。Campos-Esparza等28研究發(fā)現(xiàn)芒果苷對局部缺血的腦損傷模型神經(jīng)具有保護(hù)作用，這些作用有助于顯著減少谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。Pardo-Andreu等32發(fā)現(xiàn)芒果苷對線粒體具有強(qiáng)抗氧化性。Satish Rao等33研究證實(shí)芒果苷預(yù)處理增加了HepG2細(xì)胞存活，抑制氯化鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。目前，芒果苷對缺氧損傷的細(xì)胞保護(hù)作用尚未見報(bào)道。作者通過MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示, 隨著氯化鈷作用時間和濃度的增加, 對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)一定的時間、劑量依賴性；芒果苷能減少氯化鈷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的抑制率，減少氯化鈷對細(xì)胞的毒性作用

46、，其保護(hù)結(jié)果有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷模型下的細(xì)胞凋亡率Annexin V和碘化丙啶雙染色，發(fā)現(xiàn)芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷具有保護(hù)作用，具有濃度依賴性；隨著芒果苷濃度的增加，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧損傷模型下的凋亡率逐步減少，差異有非常顯著性意義。通過流式細(xì)胞儀檢測大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷模型下線粒體膜電位凋亡結(jié)果，基本與Annexin V和碘化丙啶雙染色凋亡率檢測一致。說明氯化鈷可通過細(xì)胞外及線粒體兩個途徑誘導(dǎo)凋亡。芒果苷也能對這兩個通路進(jìn)行調(diào)控，保護(hù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，減少凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氯化鈷能通過缺氧損傷模型誘發(fā)

47、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡。文章首次報(bào)道芒果苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧損傷誘發(fā)的凋亡具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制通過細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)兩個凋亡途徑同時進(jìn)行調(diào)控。芒果苷對細(xì)胞凋亡途徑其他凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控，還有待進(jìn)一步研究。致謝：感謝廣西自治區(qū)人民醫(yī)院藍(lán)嬌老師在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測等方面給予的幫助。作者貢獻(xiàn)：趙勁民負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，李曉峰、羅世興、程建文、譚楨負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施，趙勁民負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)評估，羅世興負(fù)責(zé)資料收集，李曉峰成文，趙勁民審校，趙勁民對文章負(fù)責(zé)。利益沖突：課題未涉及任何廠家及相關(guān)雇主或其他經(jīng)濟(jì)組織直接或間接的經(jīng)濟(jì)或利益的贊助。倫理要求：實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合2009年

48、Ethical issues in animal experimentation相關(guān)動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。學(xué)術(shù)術(shù)語：細(xì)胞缺氧損傷模型-細(xì)胞缺氧損傷模型的建立對于研究細(xì)胞缺血損傷機(jī)制、缺血適應(yīng)變化及藥物缺氧保護(hù)機(jī)制等意義重大。目前，細(xì)胞缺氧模型一般有兩類：物理性缺氧復(fù)氧模型和化學(xué)性細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型。作者聲明：文章為原創(chuàng)作品，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，內(nèi)容不涉及泄密，無一稿兩投，無抄襲，無內(nèi)容剽竊，無作者署名爭議，無與他人課題以及專利技術(shù)的爭執(zhí)，內(nèi)容真實(shí)，文責(zé)自負(fù)。4 參考文獻(xiàn) References1 李曉峰,趙勁民,蘇偉,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定J. 中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(10

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