Transwell侵襲實驗

1、精選文檔Transwell侵襲試驗1.試驗前一天將ECM膠（8-12 mg/ml）（Sigma）放于4冰箱中溶化過夜2.試驗時將所用的槍頭在冰上預(yù)冷半個小時，ECM膠用預(yù)冷的無血清1640按1：9稀釋（稀釋至1mg/ml），每孔中加入稀釋好的ECM膠40l，放入37培育箱中，孵育5h3.水化基底膜：吸出小室中殘余液體，每孔加入70ul含無血清1640培育液，37，30min，吸去培育基4.對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，0.1%血清1640懸浮，計數(shù)，稀釋至密度為1´106/ml，每空中加200l細(xì)胞懸液5.24孔板下室一般加入600µl含30%新生牛血清的1640培育基6

2、.24h后，棄去孔中培液，PBS洗2遍，甲醇固定20分鐘，0.1%結(jié)晶紫染色15-20 min，用清水洗3遍以上，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞7.400倍顯微鏡下隨即五個視野觀看細(xì)胞，記數(shù)個人覺得做Transwell就像小馬過河一樣，要講究個體化，不同的細(xì)胞侵襲力量不同，膠的稀釋倍數(shù)、細(xì)胞上樣量、上下室血清濃度差以及孵育時間也不同。對于你的問題，我覺的不管是在溫箱中放5個小時或者是在超靜工作臺中風(fēng)干，其主要目的是為了讓Matrigel從液體狀變成膠凍狀，在溫箱中放置5個小時后，拿出來上室中確定會有液體殘留，此時肯定要將殘留的液體洗潔凈，然后在水化一下基底膜。(1) 吸去培育液，用棉簽輕輕擦除上

3、室聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)面貼壁細(xì)胞，用0.01MPBS漂洗兩次，4%多聚甲醛固定10 分鐘；(2) 吸去固定液，將膜風(fēng)干，每孔加0.6ml 0.1%結(jié)晶紫染液，室溫中放置20 分鐘；(3) 輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將上室取出，從聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)面用吸水紙吸干水分，自然干燥；(4) 測定前，將各試驗組上室置入新的24 孔板中，每孔加0.6ml 33醋酸脫色，充分振蕩，每組設(shè)定5 復(fù)孔；同時設(shè)置調(diào)零孔（33醋酸）；比色：每孔取脫色液150l 加入96 孔板中，在570nm 處測定OD 值。2步驟21 Transwell小室制備211 無基質(zhì)膠Transwell小室制備 包被基底膜（冰浴操作）：用5

4、0mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面。24孔板每空50-70uL:20uL Matrigel + 160uL DMEM/F-124°風(fēng)干，過夜。假如需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培育板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培育液，37，30min。另有tianjin_glioma戰(zhàn)友供應(yīng)的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80

5、µl (留意體積不行太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37 30min使Matrigel聚合成凝膠。212 有基質(zhì)膠的Transwell小室制備Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培育板中，在上室加入300µl預(yù)溫的無血清培育基，室溫下靜置1530min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培育液。22 制備細(xì)胞懸液 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓1224h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必需的。 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培育液，用PBS洗12遍，用含BSA的無血清培育基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至110×105，個人認(rèn)為不要超過5

6、5;105。具體試驗時接受密度要自己摸索，由于不同細(xì)胞，其侵襲力量是不同的。個人閱歷，細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會過多過快，假如最終用計數(shù)法統(tǒng)計結(jié)果的話將難以計數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，全部的細(xì)胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內(nèi)還要有肯定量的細(xì)胞存在。個人認(rèn)為，對比組和處理盡量不要分開計數(shù)，由于細(xì)胞數(shù)目的差異會嚴(yán)峻影響試驗結(jié)果。假如需要對細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開計數(shù)，那么計數(shù)肯定要多重復(fù)幾次，力求精確，盡量保證對比組和處理組細(xì)胞密度全都。23 接種細(xì)胞 取細(xì)胞懸液100200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對細(xì)胞懸液

7、量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200µl。 24孔板下室一般加入500µl含F(xiàn)BS或趨化因子的培育基，不同的培育板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特殊留意的是，下層培育液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培育液的趨化作用就減弱甚至消逝了，在種板的時候要特殊留心，一旦消滅氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培育板。 培育細(xì)胞：常規(guī)培育1248h（主要依癌細(xì)胞侵襲力量而定）。時間點的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不行忽視。以我的課題為例，我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細(xì)胞侵襲力，還對細(xì)胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物

8、濃度是用MTT篩選出的72h的IC50。用這個濃度處理細(xì)胞，24h內(nèi)對細(xì)胞增殖并無明顯抑制，但24h后，抑制作用就開頭消滅了。所以，用這個濃度來做Transwell，處理時間也必需限定在24h內(nèi)，否則一旦藥物抑制了細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)出凋亡，使處理組細(xì)胞數(shù)目少于對比組，那么就難以確定穿過膜的細(xì)胞比對比組少，到底是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細(xì)胞數(shù)目本身就比對比組少而引起的了。時間過長不行以，同樣，過短也不行，由于細(xì)胞內(nèi)會有肯定量的MMPs儲存，短時間內(nèi)可能侵襲力量不會有太大轉(zhuǎn)變。同時從藥物被吸取進(jìn)去，進(jìn)而發(fā)揮作用，影響MMPs表達(dá)，到最終釋放到培育基中，還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長點，也

9、可選擇多個時間點爭辯時間依靠效應(yīng)，但前提是這個時間范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不能有明顯變化。另外，我看到細(xì)胞在小室內(nèi)的形態(tài)不是正常培育貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時的形態(tài)，不過會聚集成團(tuán)，所以看到細(xì)胞不正常貼壁也不要緊急，是正?，F(xiàn)象在培育過程中，膜下會漸漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培育一段時間后，膜下消滅了大氣泡，幸虧準(zhǔn)時發(fā)覺，否則后果將格外嚴(yán)峻。因此，個人建議，最好接種細(xì)胞后12h把培育板從培育箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。 24 結(jié)果統(tǒng)計檢測穿過的細(xì)胞數(shù)有兩種方法：241 直接計數(shù)法2411 “貼壁”細(xì)胞計數(shù)這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)

10、而不會掉到下室里面去。通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計數(shù)細(xì)胞 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺肦藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。個人推舉接受0.1%結(jié)晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢：(1). 不需要固定細(xì)胞，直接染色即可。(2). 配制簡潔便利。(3). 染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm 測其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。個人認(rèn)為這是結(jié)晶紫染色最大的優(yōu)勢所在。由于，雖然經(jīng)過精確的細(xì)胞計數(shù)，往往穿過膜的細(xì)胞數(shù)仍難以精確把握，可能某一批試驗穿過的細(xì)胞會特殊多，以致細(xì)胞成堆，這種狀況下就難以計數(shù)了，這種狀況下就可以

11、用醋酸脫色后用酶標(biāo)儀檢測。使用結(jié)晶紫染色要留意，染色前要將膜風(fēng)干，否則可能會染不上。 細(xì)胞計數(shù)：我們使用的是Leica DC 300F正置顯微鏡進(jìn)行觀看和拍照，把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞。也有不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點鋪張。取若干個視野計數(shù)細(xì)胞個數(shù)。論壇里一般接受35個視野，也有人用10個，都是隨機(jī)選取，個人認(rèn)為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會摻進(jìn)人為影響，特殊是計數(shù)視野較少的時候。我選取16個視野，不是隨機(jī)選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微

12、鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。不同廠家不同型號的小室，膜的面積不盡相同，但個人認(rèn)為，拍照時還是應(yīng)當(dāng)選取固定的位置，并選擇盡可能多的視野。2412 “非貼壁”細(xì)胞計數(shù)由于某些細(xì)胞自身的緣由或某些膜的關(guān)系，有時細(xì)胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進(jìn)下室。這種狀況我沒有遇到過，依據(jù)論壇里供應(yīng)的閱歷，可以收集下層培育液，用流式細(xì)胞儀計數(shù)細(xì)胞量，也可用細(xì)胞計數(shù)的方法直接在鏡下計數(shù)，個人認(rèn)為MTT應(yīng)當(dāng)也是可以用的，有愛好的可以試試看。 241 間接計數(shù)法間接計數(shù)法主要用于穿過細(xì)胞過多，而無法通過計數(shù)獲得精確的細(xì)胞數(shù)所接受的方法，與常用的MTT試驗是同樣的原理。2411 MTT法 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培育基，將小室置于其中，使膜浸沒在培育基中，37 4h后取出。 24孔板中加入500µl DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10min，使甲臜