雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)

1、雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)摘要：目的 評(píng)價(jià)雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法性能。方法 配制雙縮脲試劑，并用所配雙縮脲試劑和標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)、回收試驗(yàn)、線性范圍測(cè)定。結(jié)果 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)CV%為6.42，回收試驗(yàn)平均回收率為109.3%，線性范圍測(cè)定的R²為0.9877。結(jié)論 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的性能不高，本人測(cè)得的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)CV%偏大，回收率偏高，線性范圍一般，或許這是個(gè)人操作因數(shù)，因?yàn)檫€有其他同學(xué)的結(jié)果比較好的。關(guān)鍵詞：雙縮脲法；血清總蛋白；方法學(xué)評(píng)價(jià)雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白至今已經(jīng)有近100年的歷史，其間該方法也

2、得到不斷改進(jìn)，是目前測(cè)定血清總蛋白的常用方法之一。全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程推薦Doumas雙縮脲配方作為血清總蛋白測(cè)定的常規(guī)方法1。方法學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)學(xué)生日后在工作中評(píng)價(jià)檢驗(yàn)方法非常重要，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生邏輯思維和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制具有重要作用。本文介紹雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)學(xué)生練習(xí)和掌握方法學(xué)評(píng)價(jià)有重要意義。雙縮脲試劑鑒定蛋白質(zhì)的原理：雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與二價(jià)銅離子形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反

3、應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此，也能在堿性環(huán)境中與二價(jià)銅離子結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)不需要加熱，被用來(lái)定性鑒定蛋白質(zhì)。但請(qǐng)注意：凡含有2個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)或含有1個(gè)肽鍵和1個(gè)一CSNH2、一CH2一NH2、一CH20H、一CHOHCH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì)，以及乙二酰乙二胺都有此顏色反應(yīng)。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽均有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽2。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速 ，不同的蛋白

4、質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差，不適合微量蛋白的測(cè)定。1. 儀器與試劑1.1 儀器721型分光光度計(jì)；水浴箱。1.2 試劑 牛血清白蛋白；硫酸銅結(jié)晶(CuSO45H2O)；酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O64H2O)；氫氧化鈉(NaOH)；碘化鉀(KI)；蒸餾水。2. 雙縮脲的配制2.1 稱(chēng)取6g NaOH溶于新鮮制備的25 ml蒸餾水中，配成6mol/L氫氧化鈉溶液。稱(chēng)取0.75 g硫酸銅，2.25 g酒石酸鉀鈉，1.25 g碘化鉀依次溶解于125 ml蒸餾水中在攪拌下加人6mol/L氫氧化鈉溶液25 ml，用蒸餾水定容至250 ml。配好的雙縮脲試劑應(yīng)貯存于塑料瓶中

5、(或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長(zhǎng)期保存，若瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)則衙重配。2.2 通常加入碘化鉀可以防止銅離子自動(dòng)還原形成一價(jià)氧化銅沉淀。在配制雙縮脲試劑過(guò)程中，進(jìn)行兩種不同加試劑順序，如下順序1：硫酸銅酒石酸鉀鈉碘化鉀氫氧化鈉順序2：硫酸銅碘化鉀酒石酸鉀鈉氫氧化鈉這兩種順序的區(qū)別是加酒石酸鉀鈉和加碘化鉀的順序不同，“順序1”在加完酒石酸鉀鈉后溶液是青藍(lán)色的(如圖1左)，“順序2”在加完碘化鉀后溶液顏色是褐色的(如圖1右)，但兩種順序在加完所有試劑后，顏色都是相同的，都為深藍(lán)色，如圖2。這兩種不同加試劑順序的配制方法，雖然過(guò)程不同，過(guò)程中顏色變化也不同，但最后的結(jié)果是相同的。 圖1 (左為先加

6、酒石酸鉀鈉) 圖2 (左為先加酒石酸鉀鈉)3. 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)3.1 材料 待測(cè)樣品、雙縮脲試劑、蒸餾水、721型分光光度計(jì)、水浴箱3.2 方法3.2.1 取21支試管放試管架，分別標(biāo)記空白管1支，重復(fù)測(cè)定管20支，按表1添加試劑。表1 試劑添加加人物(ml)試劑空白管測(cè)定管×20蒸餾水0.06待測(cè)樣品0.06雙縮脲試劑333.2.2 渦旋混勻后，37水浴10分鐘，在波長(zhǎng)540nm條件下比色，空白管調(diào)零，用分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度。3.2.3 計(jì)算待測(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)差S和變異系數(shù)CV%值。3.3 結(jié)果 結(jié)果記錄表2 20個(gè)測(cè)定管的吸光度值試管號(hào)吸光度試管號(hào)吸光度試管號(hào)吸光度試管號(hào)吸光度1

7、0.12160.12110.14160.1420.13170.123120.14170.14430.1480.128130.139180.13940.12990.12140.146190.14250.139100.125150.139200.139 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果處理計(jì)算公式標(biāo)準(zhǔn)差，變異系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差s=0.0086，變異系數(shù)CV%=6.423.4 討論評(píng)價(jià) 3.4.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)的CV%=6.42，CV%值比較大，超過(guò)4.0，說(shuō)明測(cè)定的精密度比較低。原因可能有以下幾點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)中使用的分光光度計(jì)比較老舊，一直性能不穩(wěn)定，多位同學(xué)使用后都表示結(jié)果不太好。使用的加樣槍很多都老化了，不好用

8、，導(dǎo)致封密性不強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)誤差大。個(gè)人加樣誤差，在一些關(guān)鍵試劑上加樣可能有誤差。所使用的比色杯經(jīng)過(guò)多次使用，比色杯壁里遺留一些有色物質(zhì)，影響了測(cè)量結(jié)果。3.4.2 通過(guò)10位同學(xué)結(jié)果的比較，如表3，有五位同學(xué)的結(jié)果小于4，另五個(gè)同學(xué)的結(jié)果大于4，最大的CV值是本人測(cè)得，說(shuō)明本人的結(jié)果比較差，雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的精密度不算太好。表3 10位同學(xué)結(jié)果的比較均值標(biāo)準(zhǔn)差s變異系數(shù)CV%本人0.13420.00866.42同學(xué)10.13530.00533.94同學(xué)20.12070.00393.24同學(xué)30.14030.00483.45同學(xué)40.14140.00412.89同學(xué)50.14990.00553

9、.66同學(xué)60.15420.00855.35同學(xué)70.11090.00534.81同學(xué)80.14610.00785.33同學(xué)90.13080.00665.054. 回收試驗(yàn)4.1 回收試驗(yàn)原理回收試驗(yàn)是反映分析方法準(zhǔn)確測(cè)定加入樣品中已知濃度或量的純分析物能力的試驗(yàn)，是評(píng)價(jià)方法準(zhǔn)確度的有效方法。回收試驗(yàn)可有效反映方法的比例系統(tǒng)誤差，也可反映方法的競(jìng)爭(zhēng)性干擾。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙縮脲法測(cè)定蒸餾水中加入的蛋白質(zhì)的回收率，判斷雙縮脲法比例系統(tǒng)誤差的大小，從而評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。4.2 回收樣品制備表4基礎(chǔ)樣品回收樣品1回收樣品2回收樣品3待測(cè)樣品0.15mL0.15mL0.15mL0.15mL150g/l蛋白0

10、.05mL0.1mL0.15mL蒸餾水0.15mL0.1mL0.05mL4.3 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的加樣，如表5表5 試劑(mL)空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管蒸餾水0.06150g/l蛋白溶液0.06樣品0.06雙縮脲試劑333注：空白管和樣品管各做一管，樣品管每個(gè)樣品做2管取平均值，共計(jì)1+1+2+2+2+2=10管。4.3.2 渦旋混勻后，37水浴10分鐘，在波長(zhǎng)540nm條件下比色，空白管調(diào)零，用分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度。4.4 結(jié)果 結(jié)果記錄表6 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的吸光度值標(biāo)準(zhǔn)管基礎(chǔ)管樣品管1樣品管2樣品管3吸光度0.3100.0490.0500.1000.1090.1530.1690

11、.2330.229平均值0.3100.0500.1050.1610.231 結(jié)果計(jì)算加入濃度(g/L)=150×(回收樣品中加入的150g/L蛋白溶液體積/0.3)回收濃度=回收樣品測(cè)得能濃度基礎(chǔ)樣品測(cè)得濃度回收率=(回收濃度/加入濃度)×100%表7 樣品回收回收樣品1回收樣品2回收樣品3加入濃度(g/L)255075回收濃度(g/L)25.953.787.6回收率1.0361.0741.168平均回收率1.093標(biāo)準(zhǔn)偏差0.068CV%6.219 回收試驗(yàn)評(píng)價(jià)一般要求回收率在95%105%，最為理想的回收率為100%，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的平均回收率為109.3%>105%

12、，根據(jù)10名同學(xué)平均回收率的比較(如表8，圖3是10名同學(xué)平均回收率的散點(diǎn)圖），有5名同學(xué)的平均回收率在95%105%之間，另五名同學(xué)的平均回收率不在95%105%之間，說(shuō)明本人的所測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確度不高；雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的準(zhǔn)確度也不太高。距離理想的準(zhǔn)確度有點(diǎn)距離。表8 10名同學(xué)樣品回收結(jié)果比較平均回收率1.0930.9640.9250.9931.0661.0901.0271.0590.9971.050標(biāo)準(zhǔn)偏差0.0680.0550.0220.0160.0380.0630.0230.0520.0350.030CV%6.2195.6532.3391.5623.5735.7682.2714.

13、8823.5002.882 圖3 10名同學(xué)平均回收率的散點(diǎn)圖5. 線性范圍評(píng)價(jià)試驗(yàn)5.1 線性范圍原理使用不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定各自的吸光度，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算雙縮脲法的線性關(guān)系方程及相關(guān)系數(shù)。5.2 試劑和儀器 150 g/L 蛋白溶液；雙縮脲試劑；蒸餾水；分光光度計(jì)；水浴箱5.3 實(shí)驗(yàn)操作5.3.1 樣品制備（樣品2-8用樣品1加相應(yīng)體積蒸餾水配制）檢測(cè)樣品1： 150 g/L 蛋白溶液0.2mL 檢測(cè)樣品2 ：125 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測(cè)樣品3 ：100 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測(cè)樣品4 ： 75 g/L 蛋白溶液0.2

14、mL檢測(cè)樣品5 ： 50 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測(cè)樣品6 ： 25 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測(cè)樣品7 ： 5 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測(cè)樣品8 ： 1 g/L 蛋白溶液0.2mL5.3.2 加樣和測(cè)定表9 加樣試劑(mL)空白管樣品管蒸餾水0.06樣品0.06雙縮脲試劑33注：空白管做一管，8個(gè)樣品每個(gè)做1管，共計(jì)1+8=9管?；靹蚝?7水浴10分鐘或室溫放置30分鐘，540nm波長(zhǎng)比色，空白管調(diào)零。5.4 結(jié)果 結(jié)果記錄表10 蛋白樣品吸光度測(cè)定結(jié)果蛋白濃度吸光度蛋白濃度吸光度1g/l-0.00475g/l0.1725g/l0.009100g/l0.20625g/l0.0571

15、25g/l0.27250g/l0.121150g/l0.331 繪制劑量反應(yīng)曲線以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以各樣品吸光度為縱坐標(biāo)作圖，EXCEL繪制吸光度-蛋白濃度曲線，同時(shí)計(jì)算線性關(guān)系方程及相關(guān)系數(shù)。 圖4 劑量反應(yīng)曲線 線性評(píng)價(jià)從劑量反應(yīng)曲線結(jié)果來(lái)看，R2=0.9877，R2偏小，這組數(shù)據(jù)的線性范圍偏差一些，但10名同學(xué)測(cè)得劑量反應(yīng)曲線的R2值比較，有7名同學(xué)測(cè)得的數(shù)據(jù)R2大于0.995，所以雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的線性關(guān)系還是比較好的。表11 10名同學(xué)測(cè)得劑量反應(yīng)曲線的R2值0.98770.99380.99580.9970.99850.99270.99570.9960.9980.99976. 總結(jié)討論本文介紹雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)，經(jīng)過(guò)配制雙縮脲試劑，并用所配雙縮脲試劑和標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)、回收試驗(yàn)、線性范圍測(cè)定。在批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，變異系數(shù)CV%為6.42，比較大，10位同學(xué)結(jié)果中，有五位同學(xué)的結(jié)果小于4，另五個(gè)同學(xué)的結(jié)果大于4，雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的精密度不算太好。在回收試驗(yàn)中，一般要求回收率在95%105%，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的平均回收率為109.3%>105%，10名同學(xué)平均回收率中有5名同學(xué)的平均回收率在95%105%之間，另五名同學(xué)的平均回收率在95%105%之外，說(shuō)明本人的所測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確度不高；雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的準(zhǔn)