色譜分析方法

1、 現(xiàn)代化學(xué)化工實(shí)驗(yàn)技術(shù)現(xiàn)代化學(xué)化工實(shí)驗(yàn)技術(shù) 和分析方法和分析方法 色色 譜譜 分分 析析 方方 法法一、色譜分析法概述 色譜分析法已成為當(dāng)代科技迅速發(fā)展時(shí)期的最適宜的最重要的分離分析方法，形成了一門新興學(xué)科色譜法。氣相色譜、液相色譜、凝膠滲透色譜、離子色譜等都得到了廣泛深入的應(yīng)用。色譜法的獨(dú)到之處在于它的高分離效能，實(shí)質(zhì)是討論譜峰間的距離和譜峰的寬窄，即所謂色譜柱的高效性和高選擇性。這兩個(gè)性能指標(biāo)的理論本質(zhì)，是由組分在兩相中分配系數(shù)不同的熱力學(xué)過程和組分在兩相中擴(kuò)散速度不同的動(dòng)力學(xué)過程所決定的。因此，要達(dá)到多組分復(fù)雜混合物通過色譜柱理想地分離，就必須從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行綜合性地研究；同

2、時(shí)對(duì)難分離物質(zhì)要選擇最佳色譜分離條件，以達(dá)到快速分離的目的。1、色譜方法的分類 隨著色譜理論的不斷完善和色譜技術(shù)的進(jìn)步，其分類方法眾多，常見的如下：用氣體作為流動(dòng)相氣相色譜法Gas chromatography(GC)液相色譜法Liquid chromatography(LC)用液體作為流動(dòng)相A、按兩相狀態(tài)分類：以流動(dòng)相狀態(tài)為準(zhǔn)劃分方法類型等十余種方法。 B、按樣品組分在兩相間分離機(jī)理分類: 利用組分在流動(dòng)相和固定相之間的分離原理不同而命名的分類方法。吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠滲透色譜法離子色譜法超臨界流體色譜法2、色譜技術(shù)問題色譜技術(shù)有如下幾方面：進(jìn)樣技術(shù)，特別是關(guān)于毛細(xì)管色譜的

3、進(jìn)樣技術(shù)；色譜柱制備技術(shù)；固定相和流動(dòng)相的選擇技術(shù)；多維色譜系統(tǒng)組合切換技術(shù)；流出組分檢測(cè)技術(shù)；程序升溫技術(shù)和剃度洗脫技術(shù)等。 這些技術(shù)都在實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用和繼續(xù)提高，是色譜工作的一個(gè)重要方面。3、色譜儀器 色譜儀器是驗(yàn)證色譜理論和色譜技術(shù)應(yīng)用的重要手段，也是建立各種分析方法的必須條件。上世紀(jì)90年代以來，色譜儀器的多樣化、高精化、智能化等程度日新月異。著名的色譜儀器廠家有：美國(guó)的安捷倫公司、日本的島津公司、waters公司等，國(guó)內(nèi)的上海、大連等公司也生產(chǎn)了質(zhì)量較高的色譜儀。4、色譜法的應(yīng)用 由于色譜法獨(dú)具特點(diǎn)，使它在各領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用。石油化學(xué)環(huán)境科學(xué)和環(huán)境保護(hù)生物學(xué)、微生物化學(xué)、生

4、命科學(xué)食品工業(yè)、農(nóng)林牧漁業(yè)醫(yī)學(xué)及醫(yī)藥學(xué)商品檢驗(yàn)應(yīng)用領(lǐng)域二、色譜法的本質(zhì)及流程 1、 色譜法的本質(zhì)色譜法的本質(zhì)在于色譜柱高選擇性和高效能的分離作用與高檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合。 混合組分的樣品在色譜柱中分離的依據(jù)是：同一時(shí)刻進(jìn)入色譜柱中的各組分，由于在流動(dòng)相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用的不同，隨流動(dòng)相在色譜柱中運(yùn)行時(shí)，在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次（103106）地分配過程，使得原來分配系數(shù)具有微小差別的各組分，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進(jìn)而各組分在色譜柱中的移動(dòng)速度就不同，經(jīng)過一定長(zhǎng)度的色譜柱后，彼此分離開來，最后按順序流出色譜柱而進(jìn)入信號(hào)檢測(cè)器，在色譜數(shù)據(jù)機(jī)上顯示出各組分的色譜行為和譜峰數(shù)值

5、。2、 色譜方法的裝置系統(tǒng)流程色譜方法裝置流程圖見下圖5-記錄儀二、色譜法的本質(zhì)及流程 1-流動(dòng)相及控制裝置；2-流動(dòng)相凈化器3-色譜柱4-檢測(cè)器三、色譜分析法的一般特點(diǎn)1、 高選擇性 色譜分析方法對(duì)那些性質(zhì)極為相似的物質(zhì)，如同位素、同系物和烴類異構(gòu)體等有良好的分離效果。這種選擇分離，主要采用高選擇性固定液，使各組分間的分配系數(shù)能產(chǎn)生較大的差別而實(shí)現(xiàn)保留值不同。 2 、高效能 色譜分析法對(duì)那些沸點(diǎn)極為相近的多組分混合物和極其復(fù)雜的多組分混合物，有能力改善它們的峰形，使各組分彼此間有良好的分離效能。這種高效能作用,主要是通過色譜柱具有足夠的理論塔板數(shù)（填充柱為幾千塊/m，毛細(xì)管柱可達(dá)105106

6、塊/m）來實(shí)現(xiàn)的。3 、高靈敏性色譜分析法的高靈敏度檢測(cè)信號(hào)，表現(xiàn)在檢測(cè)器方面。目前在色譜界已出現(xiàn)幾十種檢測(cè)器，可檢測(cè)出10111013g的物質(zhì)量。因此在痕量分析中可大顯功效 。 如 超 純 氣 體 、 高 純 試 劑 中 的ppmppb級(jí)的痕量雜質(zhì)測(cè)定，測(cè)定大氣污染物中的ppbppt級(jí)的痕量毒物；測(cè)定 農(nóng) 、 副 產(chǎn) 品 、 水 果 、 食 品 中 的ppmppb級(jí)的農(nóng)藥殘留物。4、 分析速度快 色譜分析法，特別是氣相色譜法，分析速度較快。一般較為復(fù)雜的樣品可在幾分鐘到幾十分鐘內(nèi)完成。而且現(xiàn)在的色譜儀器多數(shù)已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、計(jì)算機(jī)化，配以高速分離的色譜系統(tǒng)，分析速度會(huì)更快。5 、 GC與LC特點(diǎn)

7、之比較 兩種色譜法的根本區(qū)別在于流動(dòng)相狀態(tài)。氣相色譜法多由永久性氣體作流動(dòng)相，由于載氣相對(duì)分子質(zhì)量低，分子間空隙大，故粘度低，流動(dòng)性好，組分在氣相中運(yùn)輸速度快，流動(dòng)相滲透性強(qiáng)，因此可以增加柱長(zhǎng)，提高色譜柱理論塔板數(shù)，從而增加柱效；氣體作流動(dòng)相價(jià)格較液體的有機(jī)溶劑低廉；氣相色譜法可以選擇愈來愈多的合成新固定液；氣相色譜法分析的對(duì)象多為相對(duì)分子質(zhì)量M1000、低沸點(diǎn)、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性較好的化合物，而且，樣品必須在柱前變成氣態(tài)分子，否則不能隨載氣運(yùn)輸分離。對(duì)于大分子、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的化合物較為困難。裂解氣相色譜法可以對(duì)高分子化合物進(jìn)行裂解后分離分析。 液相色譜法采用液體作流動(dòng)相。適于作液相色譜的

8、流動(dòng)相較僅有幾種惰性氣體的GC流動(dòng)相多；流動(dòng)相對(duì)樣品組分有較好的溶解作用，且參與溶質(zhì)的分配，可增大分離的選擇性。液相色譜適于分析高沸點(diǎn)、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的、分子量（M10002000）較大的液體化合物，樣品可直接進(jìn)樣， 一般不需作樣品衍生化處理。 選擇好流動(dòng)相是改善液相色譜分離的關(guān)鍵之一（液體種類繁多，選用二元或三元流動(dòng)相時(shí)同時(shí)洗脫，改變載液的種類濃度、比例、極性、pH穩(wěn)定等，則可以提高LC的分離度）；流動(dòng)相因?yàn)槭且后w，所以密度較高，組分?jǐn)U散系數(shù)（DL）低（大約占?xì)怏w的105），故LC分析速度慢；液體粘度大于氣體100多倍，傳質(zhì)也較慢，故采用小顆粒，窄分布固定相和高壓泵強(qiáng)制流動(dòng)相通過色譜柱以

9、獲得高效率分離；高效液相色譜有其獨(dú)特的檢測(cè)器，如紫外檢測(cè)器、示差檢測(cè)器、熒關(guān)檢測(cè)器等，它們都有高的靈敏度；高效液相色譜可進(jìn)行大組分量制備，收集柱流出組分十分方便。四、色譜基本理論1、 色譜圖 色譜圖是色譜柱流出物通過檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或載氣流出體積的曲線圖。色譜圖是色譜基本參數(shù)的源流，可根據(jù)色譜圖中峰位置點(diǎn)進(jìn)行定性，根據(jù)峰高或峰面積進(jìn)行定量；根據(jù)各峰不同的位置及其峰寬變化狀態(tài)，可對(duì)色譜柱的分離性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，表征色譜操作條件的優(yōu)劣。2、色譜圖相關(guān)名詞 （色譜）峰（Chromatographic）Peak色譜柱流出組分通過檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線。 峰底Peak ba

10、se 峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線（見圖3中的CD）。 峰高（h）Peak Height從峰最大值到峰底的距離（見圖3中的BE）。 峰寬（W）Peak Width在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離（見圖3中的KL）。 色譜流出曲線圖 半高峰寬（Wh/2）Peak Width at half height 通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離（見圖3中的HJ）。 峰面積（A）Peak area 峰與峰底之間的面積（見圖3中的CHEJDC）。 標(biāo)準(zhǔn)偏差（）Standard error 0.607倍峰高處所對(duì)應(yīng)峰寬之一半。 拖尾峰Tailing Peak后沿較

11、前沿平緩的不對(duì)稱的峰。 前伸峰leading Peak前沿較后沿平緩的不對(duì)稱的峰。假峰Ghost Paek并非由試樣所產(chǎn)生的峰?；畏?Distorted Peak形狀不對(duì)稱的峰，如拖尾峰、前伸峰?；€Baseline 在正常操作條件下，僅有載氣通過檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的曲線?；€漂移Baseline drift基線隨時(shí)間定向的緩慢變化?；€噪聲（N）Baseline noise由各種因素所引起的基線波動(dòng)。三、色譜基本參數(shù) 1、 死時(shí)間（tM）Dead time 不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出峰最大值所需的時(shí)間（見圖3中的tM）。2、 保留時(shí)間（tR）Retention time 組

12、分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間（見圖3中的tR） 調(diào)整保留時(shí)間（tR）Adjusted retention time 減去死時(shí)間的保留時(shí)間（見圖3中的tR） tRtR.tM3、 死體積（VM）Dead Volume 不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的載氣體積。4、 保留體積（VR）Retention Volume組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的載氣體積。VR= tR.FC FC載氣流速（ml/min）。5、 柱效能Colume efficiency色譜柱在色譜分離過程中主要由動(dòng)力學(xué)因素（操作參數(shù)）所決定的分離效能。通常用理論板高或有效板數(shù)表示。、理論板數(shù)（n）Number of

13、theoretical plate表示柱效能的物理量，可由下式計(jì)算n=5.54(tR/W)n=5.54(tR/W)2 2=16()=16()2 2、理論板高（H）Height equivalent to a theoretical plate單位理論板的長(zhǎng)度。H=L/n 有效板數(shù)（neff）Number of effective plate減去死時(shí)間后表示柱效能的物理量，可由下式計(jì)算：neff5.54()5.54()2 2=16()=16()2 2色譜的定性分析 一般定性 1、用已知物直接對(duì)照法定性利用已知物直接對(duì)照法定性，是一種簡(jiǎn)單可靠的定性方法，在具有已知標(biāo)準(zhǔn)物情況下常使用這種定性方法。該

14、方法定性的依據(jù)是：在一定的柱條件（柱長(zhǎng)、固定相）操作條件下，組分有固定的保留值。因此，控制條件一定，比較已知物和未知物的保留值，就可方便地確定某一色譜峰是什么物質(zhì)。A、利用保留時(shí)間和保留體積定性利用保留時(shí)間tR定性是最簡(jiǎn)單地一種定性方法。只要準(zhǔn)確測(cè)量未知物和標(biāo)準(zhǔn)物地保留時(shí)間進(jìn)行比較，相同者為同一物質(zhì)。利用保留時(shí)間定性，缺點(diǎn)是tR受操作條件影響大，載氣流速微小的波動(dòng)、穩(wěn)定微小的變化都會(huì)使tR改變，從而給定性帶來困難。用保留體積VR定性，不受載氣流速的影響，操作也很方便。B、用相對(duì)保留值定性利用保留時(shí)間或保留體積定性受條件影響大。保留體積雖不受流速影響，仍受其它操作條件影響。而相對(duì)保留值僅受柱溫、

15、固定相性質(zhì)影響，柱長(zhǎng)、填充情況、流速等均不影響ris值。因此在柱溫、固定相一定時(shí)，ris為定值，可作為定性的較為可靠的參數(shù)。C、用已知物增加峰高法定性如果樣品組成復(fù)雜，峰間距小，這時(shí)要準(zhǔn)確定出保留值有一定困難，峰高增加法是在此條件下最可靠的定性方法。具體方法是：先進(jìn)一樣品，得一譜圖，然后在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同樣條件下進(jìn)一針標(biāo)樣品，從新得到的譜圖上看，哪個(gè)峰高了，那么，該峰就是加入的標(biāo)準(zhǔn)物組分。2、色譜定量分析色譜分析的重要作用之一是對(duì)樣品定量。色譜法定量的依據(jù)是：組分的重量或在載氣中的濃度與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)成正比。在此，響應(yīng)信號(hào)指峰面積或峰高，表示為：wi=fiAi，其中wi為欲測(cè)組

16、分I的量，Ai為組分I的峰面積，fi為比例系數(shù)，在此稱為校正因子。因此，要準(zhǔn)確定量，首先要準(zhǔn)確測(cè)出峰面積與定量校正因子。定量校正因子是定量計(jì)算公式中的比例常數(shù)，其物理意義是單位峰面積所代表的被測(cè)組分的量。定量分析的依據(jù)是被測(cè)組分的量與響應(yīng)信號(hào)成正比，但是，同一含量的不同物質(zhì)，由于其物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，即使在同一檢測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)大小也不同，直接用響應(yīng)信號(hào)定量，必然產(chǎn)生較大誤差。因此提出了定量校正因子。定量校正因子對(duì)信號(hào)加以校正，校正后的峰面積可定量地代表物質(zhì)的含量。A、 面積的測(cè)量 對(duì)稱峰面積的測(cè)量對(duì)稱色譜峰近似地看作一個(gè)等腰三角形等腰三角形，按照三角形求面積的方法，峰面積為AihiW，經(jīng)驗(yàn)

17、證明該方法計(jì)算的面積只有實(shí)際面積的0.94倍，故再乘一系數(shù)1.065，Ai1.065 hiW，這是目前應(yīng)用較廣的計(jì)算法。1、 不對(duì)稱峰面積的測(cè)量在色譜分析中，經(jīng)常會(huì)遇到不對(duì)稱峰，多數(shù)不對(duì)稱峰為拖尾峰，峰面積的計(jì)算方法為：取峰高0.15倍處和0.85倍處峰寬平均值，乘峰高：A=(W0.15h+W0.85h)h 峰高在定量分析中的作用峰高在定量分析中的作用峰高也可作為定量指標(biāo)，對(duì)于一定的樣品，如果操作條件保持不變，在一定的進(jìn)樣量范圍內(nèi)，半高峰寬是不變的，峰高可直接代表組分的濃度，由峰高代替面積計(jì)算。方法快速、簡(jiǎn)便，適用于固定不變的常規(guī)分析。與使用面積定量法比較，對(duì)于出峰早的組分，由于半高峰寬很小，

18、相對(duì)誤差大，這時(shí)用峰高定量更準(zhǔn)確。對(duì)于出峰晚、峰較寬的組分，用峰面積定量更準(zhǔn)確。百分含量的計(jì)算 1、 歸一化法歸一化法 歸一化法是常用的一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的定量方法。使用這種方法的條件是樣品中所有組分都出峰，將所有出峰組分的含量之和按100計(jì)，當(dāng)測(cè)量參數(shù)為面積時(shí)，計(jì)算如下： xi%= =100 式中 xi-試樣中組分i的百分含量； fi-組分i的校正因子； Ai-組分i的峰面積。如果樣品中組分是同分異構(gòu)體或同系物，已知校正因子近似相等，就可以不用校正因子，將面積直接歸一化，即可按下式計(jì)算：xi(%)= =100 xi(%)= =100 歸一化定量的優(yōu)點(diǎn)是方法準(zhǔn)確，進(jìn)樣量的多少與結(jié)果無關(guān)，儀器與操作

19、條件對(duì)結(jié)果影響小。缺點(diǎn)是某些組分在所用檢測(cè)器上可能不出峰，樣品中含有沸點(diǎn)高，出峰很慢的組分，不需定量的個(gè)別組分可能分離不好，重疊在一起，影響面積的測(cè)量，使其應(yīng)用受到一定程度的限制。2 2、 外標(biāo)法外標(biāo)法外標(biāo)法又稱校正曲線法。用已知純樣品配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)量各種濃度下對(duì)應(yīng)的峰高或峰面積，繪制響應(yīng)信號(hào)百分含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析時(shí)，進(jìn)入同樣體積的分析樣品，從色譜圖上測(cè)出面積或峰高，從校正曲線上查出其百分含量。在一些工廠的常規(guī)分析中，樣品中各組分中的濃度一般變化不大，在檢量線通過原點(diǎn)時(shí)可不必做校正曲線，而用單點(diǎn)校正法來分析。即配制一個(gè)和被測(cè)組分含量十分接近的標(biāo)準(zhǔn)樣，定量進(jìn)樣，由被測(cè)組分與外標(biāo)

20、組分峰面積或峰高比求被測(cè)組分百分含量。xi= Ei式中 xi-試樣中組分i的含量； Ei標(biāo)準(zhǔn)樣中組分i的含量； AE標(biāo)準(zhǔn)樣中組分i的峰面積。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單和計(jì)算方便。缺點(diǎn)是儀器和操作條件對(duì)分析結(jié)果影響很大，不像歸一化和內(nèi)標(biāo)法定量操作中可以互相抵消。因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線使用一段時(shí)間后應(yīng)當(dāng)校正。3、 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法當(dāng)分析樣品不能全部出峰，不能用歸一法定量時(shí)，可考慮用內(nèi)標(biāo)法定量。方法：準(zhǔn)確稱取樣品，選擇適宜的組分作為預(yù)測(cè)組分的參比物，也稱內(nèi)標(biāo)物。加入一定量的內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量及在色譜圖上相應(yīng)的峰面積比按下式求組分的含量;xi(%)=100式中 xi-試樣中組分I的百分含量； ms-加入

21、內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量； As-內(nèi)標(biāo)物的峰面積； m-試樣的質(zhì)量 Ai-組分I的峰面積；fsi=fi/fs。對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求是：不能與樣品或固定相發(fā)生反應(yīng)；能與樣品完全互溶；與樣品組分很好的分離，又比較接近；加入內(nèi)標(biāo)的量要接近被測(cè)組分的含量；要準(zhǔn)確稱量。內(nèi)標(biāo)法定量非常準(zhǔn)確，主要缺點(diǎn)是：內(nèi)標(biāo)物不容易找到；每次需要用分析天平準(zhǔn)確稱量?jī)?nèi)標(biāo)和樣品，日常分析使用很不方便，樣品中多了一個(gè)內(nèi)標(biāo)物，顯然對(duì)分離的要求更高些。4、 疊加法疊加法又叫內(nèi)加法，是以樣品中已有的組分做內(nèi)標(biāo)，比較該組分加入前后面積的改變，計(jì)算被測(cè)組分含量。其步驟如下：先做樣品色譜圖，然后在原樣品中定量加入含量較小組分的純樣品，同樣條件下，再進(jìn)一色譜樣

22、得一色譜圖。定量分析誤差的來源 除峰面積與校正因子測(cè)量精度外，定量結(jié)果的準(zhǔn)確性還受如下因素的影響：1、 樣品的穩(wěn)定性及代表性樣品的穩(wěn)定性及代表性樣品的代表性是得到準(zhǔn)確定量結(jié)果的前提。 氣相色譜分析的許多樣品是氣體或揮發(fā)性液體，因此，要特別注意泄漏、揮發(fā)等問題，同時(shí)，從取樣到進(jìn)樣要快速，盡量避免樣品組分的揮發(fā)損失。液相色譜取樣要注意樣品的均勻性，樣品是否完全溶解組成均勻的溶液，溶解樣品的溶劑最好就是流動(dòng)相，或是與流動(dòng)相互溶的溶劑。2、 進(jìn)樣系統(tǒng)影響進(jìn)樣系統(tǒng)影響采用定體積進(jìn)樣法作定量分析，進(jìn)樣的重復(fù)性是一個(gè)很關(guān)鍵的問題。對(duì)于氣體樣品，一般都采用進(jìn)樣閥，重復(fù)性好，液體樣品一般用微量注射器。3、 柱系

23、統(tǒng)的影響柱系統(tǒng)的影響如果色譜柱不能將組分完全分離，有重疊峰或嚴(yán)重拖尾峰，那么，無論用何種測(cè)量方法也會(huì)有誤差。因此，保證色譜峰良好的分離是定量準(zhǔn)確的必要條件。同時(shí)要注意保養(yǎng)柱子，以保證良好的重現(xiàn)性。4、 氣相色譜操作條件的影響、柱溫柱溫直接影響保留值和峰高，不同組分保留值的對(duì)數(shù)值隨柱溫變化的直線斜率是不同的，如果要減小柱溫造成的誤差，柱溫應(yīng)控制在0.5范圍以內(nèi)。、檢測(cè)溫度對(duì)于熱導(dǎo)池檢測(cè)器，溫度升高，靈敏度下降，它的影響比柱溫影響小，允許溫度變化1。、載氣流速的影響對(duì)于熱導(dǎo)池檢測(cè)器，是測(cè)量流動(dòng)相中組分濃度的瞬間變化，即響應(yīng)信號(hào)與流動(dòng)相中組分濃度成正比。流速加大，濃度不變，故峰高與流速無關(guān)，峰面積與

24、流速成反比。對(duì)于氫火焰離子化檢測(cè)器，測(cè)量的是單位時(shí)間進(jìn)入檢測(cè)器的物質(zhì)量。流速加大，單位時(shí)間進(jìn)入的量增大，峰高增加，面積與流速無關(guān)，因此在絕對(duì)定量時(shí)，用面積定量誤差小一些。高效液相色譜法高效液相色譜法 液相色譜是色譜中的一類分離與分析技術(shù)，其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相。對(duì)于大量有機(jī)化合物、離子型化合物以及易受熱分解或失去活性的物質(zhì)，不能直接或不適合用氣相色譜方法進(jìn)行分析，因此高效液相色譜的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大和深入。特別是近幾十年來，液相色譜固定相的高度發(fā)展，儀器不斷更新，高效液相色譜目前已成為許多學(xué)科科學(xué)研究和日常分析的重要手段。一、高效液相色譜法的特點(diǎn) 1、高效液相色譜可以分離分析高極性，高分子量和

25、離子型的各種物質(zhì)，只要被分析對(duì)象能夠溶解于可作為流動(dòng)相的溶劑中并能夠被檢測(cè)，就可以直接進(jìn)行分析。某些目前尚不能被直接檢測(cè)，或檢測(cè)靈敏度不夠的，也可以采用各種衍生技術(shù)，實(shí)現(xiàn)這些物質(zhì)的檢測(cè)。2、高效液相色譜儀主要由高壓輸液泵、進(jìn)樣閥、柱子和檢測(cè)器等組成。3、柱子的柱效（以理論板數(shù)計(jì)）很高，每米可達(dá)3萬塊以上。一般只使用2025cm長(zhǎng)的柱子。由于填料的不斷發(fā)展和改進(jìn)，目前最短的柱子只有3cm長(zhǎng)，板數(shù)可達(dá)30004000。已能夠滿足一般分析的需要，并具有很高的分析速度。4、高效液相色譜儀通常在室溫下操作，樣品一般不須預(yù)處理，操作簡(jiǎn)便，很容易掌握。5、高效液相色譜操作的難點(diǎn)在于流動(dòng)相的選擇?？梢圆捎眉?nèi)?/p>

26、劑，二元或多元混合溶劑作流動(dòng)相。但流動(dòng)相的選擇必須遵循一定的規(guī)律，并以科學(xué)的方法優(yōu)選。6、高效液相色譜技術(shù)也存在一些問題。柱子價(jià)格昂貴，要消耗大量的溶劑，而且許多溶劑對(duì)人體是有害的。高效液相色譜儀的價(jià)格和損耗也比氣相色譜儀高。此外，尚缺少象氣相色譜中氫火焰離子化檢測(cè)器那樣的通用型、高靈敏度的檢測(cè)手段。因此，高效液相色譜無論在技術(shù)上，在理論上，還是在應(yīng)用上都處于發(fā)展階段。二、高效液相色譜系統(tǒng) 下圖是高效液相色譜系統(tǒng)的示意圖。它由輸液泵為核心的輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣器、柱子和檢測(cè)器四個(gè)基本部分組成。實(shí)際儀器比圖要復(fù)雜得多，它們可能有幾個(gè)泵，幾種檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，柱和檢測(cè)器的溫度控制系統(tǒng)等。 1、 輸液

27、系統(tǒng)輸液系統(tǒng)的作用是向柱子提供壓力高，流速穩(wěn)定的流動(dòng)相。它以高壓輸液泵為核心，由溶劑儲(chǔ)槽、過濾器、輸液泵、梯度溶劑混合器等組成。為了測(cè)量系統(tǒng)流量和壓力，在輸液系統(tǒng)的輸出通路上還安裝了不同類型的傳感元件。儲(chǔ)液槽儲(chǔ)液槽是盛裝溶劑的容器。它可以是一個(gè)普通的溶劑瓶，或是一個(gè)專門設(shè)計(jì)的儲(chǔ)液槽，用于除去溶劑中的氣體。過濾器各種泵的柱塞、進(jìn)樣閥的閥芯加工的精密度都非常高，微小的機(jī)械雜質(zhì)將導(dǎo)致這些部件的損壞，而不能很好的工作。同時(shí)雜質(zhì)在柱頭的積累還影響柱子的使用，增大柱壓，因此過濾溶劑，設(shè)置過濾器是必須的。過濾器的芯子通常是一個(gè)由多孔聚四氟乙烯制成的具有一定空隙度的圓柱體，鑲嵌在一個(gè)不銹鋼的殼體中，形成一個(gè)完

28、整的、安裝方便的部件。高壓輸液泵高壓輸液泵是現(xiàn)代液相色譜裝置中最關(guān)鍵的設(shè)備，輸出高壓溶劑是實(shí)現(xiàn)快速分析的前提。除了最高使用壓力外，還有線性流量范圍，輸出流量的精確度，泵的操作方式，流量輸出或壓力恒定的穩(wěn)定性，以及易于操作和維修等。高效液相色譜儀中所用的泵可分為兩類：恒壓泵和恒流泵。恒壓泵主要指氣動(dòng)放大泵，泵出口壓力在系統(tǒng)中是恒定的，流速由柱的阻力決定。恒流泵有往復(fù)泵和注射泵，這類泵輸出的溶劑流量恒定，柱前的壓力由柱后的阻力確定。目前使用最多的是往復(fù)泵。梯度洗脫裝置當(dāng)樣品是一個(gè)含有不同種類組分的復(fù)雜混合物時(shí)，通常用一種純的或固定組成的混合溶劑難以實(shí)現(xiàn)滿意的分離，往往是先溜出來的峰分不開，而后溜出

29、來的峰保留時(shí)間太長(zhǎng)。因此，在液相色譜中常在一個(gè)樣品的分析過程中，不斷調(diào)整混合溶劑的組成，改變?nèi)軇?qiáng)度或溶劑的選擇性。如果溶劑組成隨洗餾時(shí)間按一定規(guī)律變化，稱這種洗餾過程為梯度洗脫。梯度洗脫過程溶劑組成的變化可以是線性的，也可以是非線性的；可以是二元的，也可以是三元，甚至多元溶劑的混合。梯度洗脫裝置根據(jù)溶劑混合時(shí)的壓力分為兩種類型：低壓梯度和高壓梯度。低壓梯度是溶劑在常壓下混合，然后用一個(gè)高壓輸液泵把它輸送至柱系統(tǒng)中。多元溶劑在混合室或溶劑罐中混合，并以一定速度改變?nèi)軇┑慕M成。這種方式簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，只能用往復(fù)泵。高壓梯度使用兩臺(tái)高壓輸液泵，每臺(tái)輸送一種溶劑，兩臺(tái)泵輸出的溶劑在一個(gè)混合室內(nèi)混合。每臺(tái)

30、泵的溶劑流量由獨(dú)立的電路或計(jì)算機(jī)控制，它們按一定比例改變。對(duì)于梯度系統(tǒng)來說，關(guān)鍵是要保證流速的穩(wěn)定，梯度洗脫重現(xiàn)性好。因此混合室的體積應(yīng)盡可能地小，且不存在死角。進(jìn)樣裝置在液相色譜中，進(jìn)樣方式有微量注射器進(jìn)樣，進(jìn)樣閥進(jìn)樣，自動(dòng)進(jìn)樣裝置等。高效液相色譜最主要的特點(diǎn)要求進(jìn)樣器設(shè)計(jì)要耐高壓，死體積小，與溶劑接觸的部分具有很好的耐蝕性。 進(jìn)樣口處的隔墊把系統(tǒng)和外界分開。為了使隔墊能承受上百公斤的壓力，頂蓋的通孔很細(xì)，而且長(zhǎng)。在系統(tǒng)處于高壓時(shí)，用一根金屬棒壓住隔墊的通孔部分，避免內(nèi)部壓力太大把隔墊沖破。液相色譜的進(jìn)樣口目前大部分都是采用六通閥，六通閥進(jìn)樣的原理如圖所示。 進(jìn)樣時(shí)樣品中不應(yīng)混入雜質(zhì)。溶解樣

31、品的溶劑最好和使用的流動(dòng)相一致，以防止溶劑變化出現(xiàn)不溶物而堵塞柱子。檢測(cè)器檢測(cè)器在色譜系統(tǒng)中非常重要。因?yàn)橐合嗌V系統(tǒng)的所有特性都通過檢測(cè)器的輸出信號(hào)表現(xiàn)出來。目前液相色譜儀常備的檢測(cè)器主要是紫外分光光度計(jì)和光二極管陣列檢測(cè)器，示差折光儀，熒光檢測(cè)器。紫外和示差折光檢測(cè)器是液相色譜最基本的檢測(cè)器，下面介紹這兩種檢測(cè)器的工作原理。紫外、可見紫外分光檢測(cè)器這種檢測(cè)器在液相色譜中應(yīng)用最廣。幾乎是一切色譜儀必備的檢測(cè)器，它的特點(diǎn)是：噪音低、具有相對(duì)高的靈敏度、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于維修。紫外檢測(cè)器的工作原理是：當(dāng)一束紫外光通過樣品池時(shí)，入射光的一部分被溶液中的某種物質(zhì)吸收，吸收的多少取決于溶質(zhì)的性質(zhì)。溶質(zhì)的濃

32、度和響應(yīng)值之間存在線性關(guān)系。紫外檢測(cè)器有固定波長(zhǎng)檢測(cè)器，可變波長(zhǎng)檢測(cè)器兩種可變波長(zhǎng)檢測(cè)器采用氘（do）燈或氘燈與鎢絲組合的光源，波長(zhǎng)在190800nm范圍可調(diào)。示差折光檢測(cè)器示差檢測(cè)器的工作原理每一種物質(zhì)在一定的溫度、壓力等條件下都有固定的折光指數(shù)。樣品組分從柱中洗餾出來與流動(dòng)相組成一混合物，它的折光指數(shù)與純流動(dòng)相或純?nèi)苜|(zhì)都不相同。示差折光檢測(cè)器就是以純?nèi)軇┳鲄⒄瘴?，連續(xù)監(jiān)測(cè)柱后洗餾物折光指數(shù)的變化，并根據(jù)變化的差值決定樣品中各組分的量由于折光指數(shù)具有加合性，任何溶劑都具有一定的折光指數(shù)，因此對(duì)所有物質(zhì)都有響應(yīng)，是通用型檢測(cè)器。三、高效液相色譜柱 1、 柱型目前液相色譜常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為4

33、.6或3.9mm,長(zhǎng)度為2025cm的不銹鋼柱。柱流動(dòng)相的體積流速是每分鐘1ml左右。填料顆粒度510m，柱效以理論板數(shù)計(jì)大約在700010000。液相色譜柱發(fā)展的趨勢(shì)，一是減少顆粒度（35m）提高柱效，縮短柱長(zhǎng)，提高分析速度。另一方面是減小柱徑，節(jié)省溶劑用量，提高檢測(cè)濃度，特別是用于復(fù)雜組分的分析。2、 柱的選擇性柱的選擇性主要指柱固定相對(duì)分離的控制。固定相對(duì)不同類型的化合物有一定的選擇性。選擇固定相的一般標(biāo)準(zhǔn)還是以“相似相溶”原理為基礎(chǔ)。如果溶質(zhì)溶于烴類溶劑，表明它是低極性化合物，這樣就可以選用非極性或亞極性固定相。若樣品溶于極性溶劑中，如醇類，則可選擇極性固定相，也可以選擇非極性固定相。

34、實(shí)際上，在液相色譜中，由于每一種分離方法所用固定相的種類很少，分離主要靠溶劑的選擇。由于十八烷基（ODS或C18）柱能夠用于多種化合物的分離，因此它是最常用的固定相。3、 柱效的評(píng)價(jià) 要實(shí)現(xiàn)對(duì)溶質(zhì)分離，要求柱子具有很高的柱效。影響柱效的因素很多，對(duì)柱效的評(píng)價(jià)也就比較難，一般是測(cè)定它們的理論板數(shù)n，板數(shù)n主要依賴于保留時(shí)間（tR）與峰底寬度（Wb）的比值。Wb越窄，這項(xiàng)比值越大，柱效越高。同時(shí)還要考慮柱的滲透性，即操作條件下的最小進(jìn)口壓力，以及峰的對(duì)稱性。商品柱子在出廠時(shí)都附有一張標(biāo)準(zhǔn)譜圖，根據(jù)所標(biāo)明的條件，得到重復(fù)的譜圖，說明這根柱子是合格的。柱子經(jīng)過長(zhǎng)期使用或保存不當(dāng)，柱子的性能會(huì)下降。突出

35、的表現(xiàn)是在給定溶質(zhì)和溶劑等操作條件下，峰變寬且對(duì)稱性不好，可K值下降。計(jì)算峰不對(duì)稱性的方法見圖，峰不對(duì)稱性因子是在峰高10處測(cè)量的。如果柱子引起峰的不對(duì)稱性大于1.2，說明該柱子的質(zhì)量不好了，若超過1.6，則這根柱子就不能再使用不能再使用了。四、液相色譜流動(dòng)相及其選擇性 1、 流動(dòng)相的作用 在給定固定相的情況下，溶質(zhì)的保留和對(duì)溶質(zhì)的分離主要由溶劑的性質(zhì)決定。在液相色譜中，溶劑可以是非極性的，也可以是極性的。如果與固定相的極性相比，溶劑極性小于固定相的，稱這種色譜過程為正相液相色譜。如硅膠作為固定相，正己烷作為流動(dòng)相的吸附色譜過程。如果與此相反，溶劑的極性大于固定相，如以O(shè)DS鍵合相作為固定相，

36、水和甲醇等作為流動(dòng)相的分配色譜過程，稱為反相液相色譜。有的固定相，如NH2基鍵合相，可以使用非極性溶劑，極性溶劑，PH27的磷酸緩沖液作為流動(dòng)相。因此，正相與反相的概念是相對(duì)的，取決于兩相極性的比較。 在液相色譜中溶劑還用來溶解樣品，并用于樣品的預(yù)處理中。總之，溶劑在液相色譜中是非常重要的，不應(yīng)和氣相色譜中的載氣比較，因?yàn)楹笳咧黄饠y帶樣品的作用。2、 作為流動(dòng)相的溶劑性質(zhì)溶劑的種類和數(shù)目是很多的，但是可作為流動(dòng)相的溶劑的數(shù)目相對(duì)來說是很少的，說明溶劑的選擇在液相色譜中是比較不容易的。1所有的溶劑；2具有合適物理性質(zhì)的溶劑；3K值合適的溶劑；4值合適的溶劑可作為流動(dòng)相的溶劑至少應(yīng)該具備如下一些性

37、質(zhì)：、溶劑具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)。它不能和固定相發(fā)生不可逆的化學(xué)反應(yīng)，也不引起固定相表面活性基團(tuán)的流失及基質(zhì)的溶漲。除特殊的分配過程，溶劑只溶解樣品，而不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。、溶劑的選擇與使用的檢測(cè)器要有相溶性。在使用紫外檢測(cè)器時(shí)，溶劑應(yīng)該在選定的紫外區(qū)沒有吸收，或在溶質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)段沒有吸收。使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，溶質(zhì)和溶劑的折光指數(shù)應(yīng)有較大的差別，否則檢測(cè)靈敏度不夠高。、溶劑粘度既影響系統(tǒng)的壓降，也影響分析時(shí)間。因此使用粘度小的溶劑作為流動(dòng)相在降低操作成本和加速分析時(shí)間方面具有明顯的意義。 溶劑可以從市場(chǎng)買到并易于純化。在某些分析中，特別是檢測(cè)靈敏度高時(shí)，溶劑的純度要求很高，所以溶劑應(yīng)易于獲取并易于純化。 溶劑的沸點(diǎn)不應(yīng)太低。如果沸點(diǎn)太低在溶劑傳輸過程中易出現(xiàn)氣泡，它將影響輸送流量的精度和混合溶劑的組成。 溶劑的毒性應(yīng)盡可能小，并不易起火。大多數(shù)溶劑對(duì)人體都是有害的，因此操作者應(yīng)該注意溶劑使用中的各種安全措施。 成本低。使用液相色譜分離或分析樣品要消耗大量的溶劑，這些溶劑使用后一般都不再回收，因此應(yīng)盡可能使用低成本溶劑。3、 常用的溶劑 在日常工作中比較常用的溶劑是有限的十幾種，如表中列出的16種常用溶劑的性質(zhì)，其它可選擇的溶劑還有：異丙醇、丁醇、異丁醇、環(huán)己烷、乙醚等。4、 緩沖溶液和流動(dòng)相添加