沉淀試驗——雙向免疫擴散

1、沉淀試驗雙向免疫擴散試驗一、目的要求1. 掌握雙向免疫擴散試驗的原理和用途；2. 熟悉雙向免疫擴散試驗的操作方法。二、實驗原理可溶性抗原（如細菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液、病毒、組織浸出液等）與相應的抗體結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的白色沉淀線，稱為沉淀試驗（precipitation）。在生理條件下，抗原抗體均帶負電荷，使極化的水分子在其周圍形成水化膜，成為親水膠體。當抗原與抗體結(jié)合后，表面電荷減少，水化膜變薄；而且由于抗原抗體復合物形成后，與水接觸的表面積減少，由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。在電解質(zhì)作用下，各疏水膠體之間靠攏，形成可見的抗原抗體復合物。如果抗原成分不純，免疫動物后

2、可以產(chǎn)生針對不同抗原成分的多種抗體，于是就形成多條沉淀線，如圖2-1所示。圖2-1雙向免疫擴散試驗原理示意圖雙向免疫擴散試驗（double agar immunodiffusion test）：將可溶性抗原和抗體分別加到瓊脂板上相應的小孔內(nèi)，由于抗原和抗體各自向四周擴散，故稱雙向瓊脂擴散試驗。若抗原與抗體相對應，兩者相遇即發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原抗體復合物，由于該復合物的體積大于瓊脂的微小孔隙，于是不能擴散，并逐步聚集在一起形成白色沉淀線。每一對應抗原和抗體可出現(xiàn)一條沉淀線，出現(xiàn)沉淀帶的抗體最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價。由于抗原抗體在瓊脂內(nèi)的擴散受到濃度、分子量大小與表面電荷的影響，所以沉淀線可以出

3、現(xiàn)在抗原孔與抗體孔之間的不同位置。當抗體濃度過高時，沉淀線就靠近抗原孔，為前帶；相反，則沉淀線靠近抗體孔，為后帶。如果抗原與抗體的比例合適，則沉淀線位于兩孔中間，為等價帶，如圖2-2所示。 圖2-2 抗原-抗體結(jié)合的沉淀帶形成原理示意圖三、實驗用途：沉淀試驗廣泛應用于病毒抗原、細菌毒素或寄生蟲抗原等的診斷（圖2-3），以及各種免疫血清效價和毒素、抗毒素的測定等。四、材料：（1）耗材：小平皿、1.5mL的離心管、吸頭；（2）試劑：瓊脂糖、8.5% 高滲鹽水、待檢血清、雞卵白素 (ovalbumin, OVA)、兔抗OVA陽性血清；（3）儀器：高壓鍋、打孔器、移液器、濕盒、恒溫箱。五、實驗方法：1

4、. 瓊脂板的制備：1克瓊脂粉溶于100 mL 8.5% 高滲鹽水，電陶爐溶解，待溫度降至55左右時，傾注于平皿中，制成厚約3mm左右的瓊脂板。2. 打孔：在瓊脂板上打梅花孔（如下圖所示），孔徑為5mm,中間空和周圍孔間的距離大約為5mm。將孔內(nèi)瓊脂挑出。用酒精燈火焰封底。3. 加樣：將待檢血清作倍比稀釋，即1：2、1：4、1：8、1：16，分別加至周圍孔中，中間加OVA。4. 作用：將瓊脂板放置濕盒中，在37恒溫箱中作用24 h。5. 結(jié)果觀察：抗原抗體在凝膠為擴散，在兩孔之間比例最適合的位置出現(xiàn)沉淀帶，出現(xiàn)沉淀帶的抗體最大稀釋倍數(shù)即抗體效價。五、結(jié)果觀察 若待檢血清孔（AF）與抗原孔（Ag）之間產(chǎn)生沉淀線，并與陽性對照所產(chǎn)生的沉淀線吻合成一線，則表示陽性。如無沉淀線或與陽性血清沉淀線交叉，則表示陰性。 圖2-3 雙向免疫擴散試驗用于傳染病診斷六、注意事項打孔加樣時，不要將瓊脂劃破，以免影響沉淀線的形成?？组g距要相等。加樣時注意換吸頭。七、思考題1. 雙向瓊脂擴散實驗中怎樣通過沉淀線來判斷抗原與抗體是否對應？2. 雙向瓊脂擴散實驗中怎