植物多酚槲皮苷的腸內(nèi)吸收特征及其與腫瘤耐藥機(jī)制P-gp相互

1、植物多酚槲皮苷的腸內(nèi)吸收特征及其與腫瘤耐藥機(jī)制P-gp相互作用研究李素云1，2 李崢2，李敬來2，張振清2 （1北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京，100038；2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京，100850）摘要：目的 研究槲皮苷在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的攝取和代謝及植物多酚槲皮苷其在腸道吸收過程中與腫瘤耐藥機(jī)制P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）間的相互作用及槲皮苷在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的攝取和代謝。方法建立槲皮苷及其代謝產(chǎn)物槲皮素和異鼠李亭濃度的LC-MS測(cè)定方法，利用Caco-2細(xì)胞研究槲皮苷的胞內(nèi)攝取和代謝， 利用Caco-2細(xì)胞模型和LC-MS技術(shù)，通過測(cè)定槲皮苷、槲皮素和異鼠李亭

2、的濃度，研究槲皮苷在Caco-2細(xì)胞中的胞內(nèi)攝取和代謝，以及孵育時(shí)間和P-gp抑制劑對(duì)槲皮苷胞內(nèi)攝取和代謝的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)鈣黃綠素-AM濃度，探討槲皮苷對(duì)P-gp的抑制作用。結(jié)果 15-120min各點(diǎn)均能在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到槲皮苷，但未檢測(cè)到槲皮素和異鼠李亭，胞內(nèi)攝取呈現(xiàn)隨時(shí)間遞減的趨勢(shì)（決定系數(shù)R 2=0.713，P0.001），在120 min內(nèi)呈指數(shù)曲線下降。加入P-gp抑制劑后120min時(shí)槲皮苷的胞內(nèi)攝取量提高1.3倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041）；胞內(nèi)鈣黃綠素-AM濃度在槲皮苷作用下顯著增加（P0.05）。結(jié)論 槲皮苷即是P-gp底物，又是其抑制劑，在Caco-2細(xì)胞中

3、以完整的糖苷形式吸收，未發(fā)生觀察到胞內(nèi)轉(zhuǎn)化或代謝。關(guān)鍵詞：槲皮苷；LC/MS；Caco-2細(xì)胞；P-gp；代謝Study of The Intestinal Absorption of Quercitrin and interaction between quercitrin andWith P-gpLI Su-yun1，2 LI Zheng2，LI Jing-lai2，ZHANG Zhen-qing2 （1beijingshijitan hospital，beijing，100038；2Institute of pharmacology and toxicology，academy of m

4、ilitary medical sciences, beijing，100850）Abstract:Objective To investigate the intestinal absorption of quercitrin and the interaction between quercitrin andwith P-gp. Methods Caco-2 cell lines are used as models of human intestinal absorption and quercitrin，quercetin作者簡(jiǎn)介：李素云，女，河北省永年縣人， 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院2007級(jí)

5、在讀博士研究生，主管技師，主要從事食物中非營(yíng)養(yǎng)素食物成分營(yíng)養(yǎng)作用研究，發(fā)表論文7篇。電話：（010）66235550，；手機(jī)E-mail：blueskyunl通訊作者：張振清，研究員，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所。電話：（010）66930632，zhangzqamms6 quercitrin，quercetin and isorhamnetin in and out cell are determined by LC/MS to study cellular uptake and metabolism of quercitrin in Caco-2 cell ,an

6、d effects of incubation time and P-gp inhibition on its absorption and metabolism were evaluated as well. Cellular calcein accumulation was measured with Flow Cytometry to investigate the inhibition of quercitrin on P-gp. Result Quercitrin was found in Caco-2 cell from 15min to 120min ,but not querc

7、etin and isorhamnetin. Cellular quercitrin accumulation decreased with incubation time and exhibited a declining exponential curve at 120 min（R 2=0.713，P0.001）. Meanwhile, in the presence of P-gp inhibitor, the uptake of quercitrin by Caco-2 cells increased 1.3-fold (p < 0.05). And cellular calce

8、in accumulation significantly increased while quercitrin existed. Conclusion The results show that intact Quercitrin ,both substate and inhibitor of P-gp,was observed at 15 - 120 min and No significant converse and metabolism occurred hasnt been observed in the Caco-2 cells. Key words: quercitrin；LC

9、/MS；Caco-2 cell；P-gp；metabolism國(guó)內(nèi)外大量研究顯示，膳食中存在著大量的植物化合物，在人類健康中起著重要的作用，它們廣泛存在于蔬菜、水果、茶葉、葡萄酒以及其它植物性食物中，同時(shí)也是許多中草藥的有效成分，因此，近年來得到了廣泛的關(guān)注1，成為營(yíng)養(yǎng)學(xué)、藥理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。-建議刪除本段P-gp是最早發(fā)現(xiàn)的一種引起腫瘤多藥耐藥的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)多種藥物耐藥，在正常組織中廣泛表達(dá)，其中在腎、肝、空腸、回腸、結(jié)腸等組織上高表達(dá)2，。 Caco-2細(xì)胞來源于人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)條件下，能分化形成致密的單分子細(xì)胞層，具有微絨毛結(jié)構(gòu)，能表達(dá)多種蛋白載體和酶，具有類

10、似小腸上皮細(xì)胞且高表達(dá)P-gp的特性，近年來廣泛用于藥物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取、外排及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等腸道吸收和代謝機(jī)制的研究2，3。槲皮苷作為膳食和中藥中重要的多酚類物質(zhì)，槲皮柑作為槲皮素的糖苷衍生物，是廣泛存在于人類植物性膳食和中草藥中的重要的多酚類化合物之一，具有抗氧化、抗炎癥、抗癌、清除自由基、保護(hù)心血管功能等諸多生物學(xué)作用。因此，闡明其對(duì)P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥的作用以及與腸道P-gp間的相互對(duì)其腸道吸收的影響作用有著重要的意義。Caco-2細(xì)胞來源于人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)條件下，能分化形成致密的單分子細(xì)胞層，具有微絨毛結(jié)構(gòu)，能表達(dá)多種蛋白載體和酶，具有類似小腸上皮細(xì)胞且高表達(dá)P-gp的特性，

11、近年來廣泛用于藥物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取、外排及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等腸道吸收和代謝機(jī)制的研究2，3。本文采用體外培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃烷纹ぼ諛?biāo)準(zhǔn)品，研究槲皮苷在腸道轉(zhuǎn)運(yùn)特征及其與P-gp的相互作用以及這種作用對(duì)其腸道吸收特征的影響，以探討在腫瘤治療中營(yíng)養(yǎng)、與疾病和藥物的相互關(guān)系作用，為指導(dǎo)腫瘤的藥物治療臨床用藥和營(yíng)養(yǎng)治療提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1試劑 槲皮苷（quercetin-3-L-rhamnodiside，sigma公司）；環(huán)孢素A(Cyclosporin A，CysA，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；色譜純甲醇( Fisher公司)；DMEM 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibico公司)；胎牛血清(Hyc

12、lone公司)；非必需氨基酸Hyclone公司)；L-谷氨酰胺(Sigma公司)； 胰蛋白酶(Sigma公司)；鈣黃綠素-AM (Calcein-AM，Sigma公司)；超純水(MilliPore公司)，其他試劑均為分析純。1.2 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，Japan)；倒置電子顯微鏡(Olympus，日本)；Agilent 1100 LC/MSD SL型液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 (Agilent，美國(guó))；24孔培養(yǎng)板(Costar, 美國(guó))；Milli-Q Gradient A10 超純水器(Millipore Inc. 美國(guó))；流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))。1.3細(xì)胞培養(yǎng)條件和方法(請(qǐng)簡(jiǎn)明

13、扼要介紹方法。如有引用，請(qǐng)注明出處)Caco-2細(xì)胞株（購(gòu)自ATCC），傳代數(shù)在40-50代之間。將先將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，（培養(yǎng)基為 培養(yǎng)液為DMEM高糖培養(yǎng)基，, 培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺以及青霉素-鏈霉素雙抗液），置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。，隔天更換培養(yǎng)基。生長(zhǎng)34天細(xì)胞融合后，用0.25 %胰蛋白酶-EDTA（0.2 %）混合消化液，于37 條件下消化，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞按6×104個(gè)/cm2接種于24孔培養(yǎng)板，隔天換培養(yǎng)液，1周后開始進(jìn)行胞內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)2，3。1.4 胞內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)4 除去細(xì)胞表面附著物（如何做？），將接種有細(xì)胞

14、的24孔培養(yǎng)板用PBS清洗3次，棄上清，每孔加入含相應(yīng)濃度槲皮苷的PBS液200L (pH=7.2)。置37、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。分別于15、30、45、60、90、120min取樣。取出的細(xì)胞孵育液（細(xì)胞外液），精密加入含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液，使內(nèi)標(biāo)終濃度為10g·L-1，震蕩混勻，高速離心后取上清200L，以20 L進(jìn)樣測(cè)定槲皮苷、槲皮素和異鼠李亭濃度。細(xì)胞用PBS輕輕清洗三次，各孔加超純水200L,-80反復(fù)凍融3次，破碎細(xì)胞，精密加入含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液,同樣使內(nèi)標(biāo)終濃度為10g·L-1，震蕩2min, 高速離心后取上清150L，同上測(cè)定。P-gp陽性特異性抑制劑組，先加入

15、抑制劑（CysA（ 2×104 mg·L-1 pH=7.2) 100L，作用15min后，再加入等量含18×103mg·L-1槲皮苷的PBS液，120min后取樣，其余實(shí)驗(yàn)步驟與前述相同。用改良Lowry法檢測(cè)細(xì)胞蛋白含量，以此矯正測(cè)得的胞內(nèi)槲皮苷、槲皮素和異鼠李亭濃度，胞內(nèi)濃度用g·L-1 protein 表示。1.5槲皮苷對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取鈣黃綠素-AM的影響5試驗(yàn)分5個(gè)組，分別為試驗(yàn)組（高濃度、中濃度、低濃度組）和P-gp抑制劑陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行樣品（n=3）。制備Caco-2細(xì)胞懸液，用37 的PBS溶液清洗細(xì)胞

16、3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106·mL-1。取300L細(xì)胞懸液，試驗(yàn)組加入100L含相應(yīng)濃度槲皮苷的PBS液，P-gp抑制劑陽性對(duì)照組加入相應(yīng)濃度的P-gp陽性抑制劑CysA5，陰性對(duì)照組加PBS溶液，作用15 min后各加入100L的鈣黃綠素-AM（1m g·L-1），孵育45 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。1.6 LC/MS分析色譜柱：Agilent-C18柱（2.1mm×50 mm，3.5m）；柱溫為室溫，流動(dòng)相為含0.1% 甲酸的甲醇：水（35：65），流速0.2mL/min，進(jìn)樣20L。質(zhì)譜檢測(cè)部分用電噴霧離子源，霧化氣壓力為30

17、 psi，干燥氣流速為8L/min，干燥氣溫度為35 ，毛細(xì)管壓力3000V，四極桿溫度保持在99 ，增益為1，峰寬為0.10min，選擇正離子模式，采用選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）以提高樣品測(cè)定的靈敏度。 m/z槲皮苷為449，槲皮素為303，異鼠李亭（3-O-甲基槲皮素）為317，內(nèi)標(biāo)（丁螺環(huán)酮）為386.2。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理（采用什么軟件？）。2 結(jié)果2.1 LC/MS方法學(xué)考察LC-MS對(duì)槲皮苷、槲皮素和異鼠李亭保留時(shí)間tR分別為2.50、5.90、7.89 mi

18、n，且在目標(biāo)峰保留時(shí)間溶液中無雜質(zhì)峰干擾樣品的測(cè)定。槲皮素在52000ug·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，槲皮苷和異鼠李亭在12000ug·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，三者在10, 100和1000 ug·L-1三種濃度水平下，日內(nèi)及日間精密度均在±15%內(nèi)，符合本試驗(yàn)的測(cè)定要求。2.2槲皮苷在不同時(shí)間的胞內(nèi)攝取槲皮苷在9×103mg·L-1濃度條件下不同時(shí)間的胞內(nèi)攝取結(jié)果見圖1。在9×103mg·L-1濃度下，不同時(shí)間點(diǎn)均能在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到槲皮苷，說明槲皮苷可以以完整的分子形式直接被吸收。但胞內(nèi)攝取量呈現(xiàn)一個(gè)隨時(shí)

19、間遞減的現(xiàn)象，經(jīng)指數(shù)回歸分析，決定系數(shù)R 2=0.713，P0.001，在120 min內(nèi)呈指數(shù)曲線下降，說明槲皮苷在Caco-2細(xì)胞內(nèi)可能尚存在其他的轉(zhuǎn)化或外排機(jī)制。40.000030. 000020.000010.0000120100806040200時(shí)間（min）ExponentialObserved胞內(nèi)攝取量（(mg·L-protein）15min時(shí)點(diǎn)； 30min時(shí)點(diǎn)； 45min時(shí)點(diǎn)； 60min時(shí)點(diǎn)； 90min時(shí)點(diǎn)； 120min時(shí)點(diǎn)經(jīng)指數(shù)回歸分析，決定系數(shù)R2=0.713，P<0.001經(jīng)指數(shù)回歸分析，決定系數(shù)R 2=0.713，P0.001。不同時(shí)間槲皮苷（

20、9×103mg·L-1）的胞內(nèi)攝取呈指數(shù)曲線變化，并且隨著時(shí)間的增加而下降。圖1 槲皮苷在不同時(shí)間的胞內(nèi)攝取(mg·L-1protein) 趨勢(shì)散點(diǎn)圖2.3 120min時(shí)點(diǎn)P-gp對(duì)槲皮苷攝取的影響120min時(shí)點(diǎn)P-gp對(duì)槲皮苷胞內(nèi)攝取的影響見圖2。實(shí)驗(yàn)組只加槲皮苷，陽性對(duì)照P-gp陽性抑制劑組加入槲皮苷和P-gp陽性抑制劑cysA（2×104mg·L-1），以抑制P-gp的外排作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽性對(duì)照組由于P-gp的外排作用受到抑制，造成槲皮苷的組較不加陽性抑制劑組的胞內(nèi)攝取顯著增高，經(jīng)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，t=2.965，P=0.

21、041，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明槲皮苷是P-gp的底物（本結(jié)論的依據(jù)不足），在Caco-2細(xì)胞內(nèi)存在P-gp對(duì)槲皮苷的外排作用，P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥機(jī)制會(huì)抑制對(duì)槲皮苷在腸道的吸收產(chǎn)生陽性抑制作用。 1、2、3 為：各處理組的3個(gè)平行樣品，“average”4為：3個(gè)相應(yīng)平行樣品平均值；P=0.041；結(jié)果表明，陽性抑制劑組的胞內(nèi)攝取顯著增高，經(jīng)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，t=2.965，P=0.041圖2 120min時(shí)cysA（2×104mg·L-1)P-gp對(duì)槲皮苷胞內(nèi)攝取的影響 2.4槲皮苷在CACOCaco-2細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化和代謝6，7槲皮苷在9×103mg

22、·L-1濃度下的不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外液均未檢測(cè)到槲皮苷的脫糖基產(chǎn)物槲皮素及其進(jìn)一步的代謝產(chǎn)物異鼠李亭，說明在現(xiàn)有檢測(cè)條件下未觀察到槲皮苷在細(xì)胞內(nèi)的不發(fā)生轉(zhuǎn)化和代謝。2.5 槲皮苷對(duì)鈣黃綠素-AM細(xì)胞攝取的影響鈣黃綠素-AM是P-gp的底物4，5（文獻(xiàn)依據(jù)？），進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)在胞內(nèi)酯酶的水解下轉(zhuǎn)化為熒光性的化合物鈣黃綠素，通過對(duì)其胞內(nèi)含量的檢測(cè)（用熒光強(qiáng)度來表示），評(píng)價(jià)化合物是否具有對(duì)P-gp的抑制功能。槲皮苷在不同濃度下，胞內(nèi)鈣黃綠素的濃度見圖3。與陰性對(duì)照組（PBS）組相比，槲皮苷組和P-gp陽性抑制劑CysA組在3個(gè)不同濃度下，均可抑制P-gp底物鈣黃綠素-AM外排，導(dǎo)致鈣黃

23、綠素的胞內(nèi)濃度顯著增加。經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=26.021，P0.001，進(jìn)一步Dunnett-t檢驗(yàn)（單側(cè)），各組與PBS對(duì)照組比較，P值分別為0.010、0.001、0.001、0.023、0.002、0.005，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為槲皮苷對(duì)P-gp的外排功能有抑制作用（抑制什么？抑制功能？而且本結(jié)論的證據(jù)不足）。7654321處 理 組2200.002000.001800.001600.001400.00熒 光 強(qiáng) 度1：陰性 PBS對(duì)照組（PBS）；2：P-gp陽性抑制劑cysA 5×103mg·L-1對(duì)照組；3：P-gp陽性抑制劑cysA25×1

24、03mg·L-1對(duì)照組；4：P-gp陽性抑制劑 cysA 5×103mg·L-1組；3 cysA25×103mg·L-1組；4 cysA50×103mg·L-1對(duì)照組組；5：槲皮苷3×103mg·L-1試驗(yàn)組：槲皮苷9×103mg·L-17試驗(yàn)組： 槲皮苷3×103mg·L-1組； 6 槲皮苷9×103mg·L-1組；7 槲皮苷27×103mg·L-1試驗(yàn)組組；經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=26.021，P0.001，進(jìn)一步Dunne

25、tt-t檢驗(yàn)（單側(cè)），各組與PBS對(duì)照比較，P值分別為0.010、0.001、0.001、0.023、0.002、0.005，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為槲皮苷對(duì)P-gp有抑制作用；各組與PBS對(duì)照比較，P <0.05 圖3不同濃度槲皮苷和P-gp陽性抑制劑對(duì)鈣黃綠素-AM的胞內(nèi)攝取-圖注可參照第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)相關(guān)文章進(jìn)行修改。箱式圖3 討論槲皮柑作為槲皮素的糖苷衍生物，是廣泛存在于人類植物性膳食和中草藥中重要的多酚類化合物之一，具有抗氧化、抗炎癥、抗癌、清除自由基、保護(hù)心血管功能等諸多生物學(xué)作用。而槲皮素糖苷衍生物在腸道中的吸收與其所結(jié)合的糖基密切相關(guān)8，9。關(guān)于槲皮素糖苷衍生物的吸收

26、機(jī)制有兩個(gè)，一是槲皮素糖苷衍生物由位于腸細(xì)胞上的乳糖根皮苷酶水解釋放出槲皮素,然后被吸收；二是通過鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，被存在于胞質(zhì)內(nèi)的糖苷酶水解釋出苷元。Wieslaw Wiczkowski等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，前一吸收機(jī)制在槲皮素葡萄糖苷吸收中起主要作用8。但是，對(duì)槲皮素鼠李糖苷（槲皮苷）的吸收情形尚沒有更深入的研究和報(bào)道。Wieslaw Wiczkowski等的實(shí)驗(yàn)表明，分別給四組在給小鼠喂飼含等量槲皮素的槲皮素苷元、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷（槲皮苷）和蕓香苷,四小時(shí)后,小鼠血漿中幾乎檢測(cè)不到的槲皮素苷元和槲皮素代謝產(chǎn)物開始出現(xiàn)于血漿中，其中槲皮素-3-葡萄糖苷

27、組是槲皮素苷元的3倍，蕓香苷膳食組很低，槲皮素-3-鼠李糖苷幾乎檢測(cè)不到，因此認(rèn)為鼠李糖苷在小腸不被吸收3。而Xiao-Juan Tian等則在CACOCaco-2細(xì)胞單層模型上觀察到了槲皮苷AB和BA的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)（何謂雙向轉(zhuǎn)運(yùn)？）6，但對(duì)槲皮苷以什么形式進(jìn)入細(xì)胞和在胞內(nèi)是否發(fā)生了轉(zhuǎn)化或代謝，該文未予研究。本實(shí)驗(yàn)利用貼壁生長(zhǎng)的Caco-2，通過切斷槲皮苷的基底側(cè)出胞途徑(如何做到?)，觀察槲皮苷在Caco-2的胞內(nèi)攝取，發(fā)現(xiàn)槲皮苷以完整的糖苷形式進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞抽提液（內(nèi)液）和細(xì)胞孵育液（外液）中都均未檢測(cè)到槲皮苷的脫糖苷產(chǎn)物槲皮素苷元以及槲皮素的甲基化代謝產(chǎn)物異鼠李亭10 ，說明槲皮苷可以被

28、腸道吸收模型Caco-2細(xì)胞完整地吸收，在現(xiàn)有檢測(cè)條件下腸道吸收模型CACO-2細(xì)胞中槲皮苷沒有觀察到槲皮苷發(fā)生的胞內(nèi)轉(zhuǎn)化和代謝。-本文與Xiao-Juan Tian相同，也采用Caco-2細(xì)胞，但結(jié)果卻不一樣，請(qǐng)分析原因？但是否存在乳糖根皮苷酶水解途徑，由于CACO-2細(xì)胞上該酶的表達(dá)較低下，因此，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和研究。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還觀察到，槲皮苷的胞內(nèi)攝取呈現(xiàn)一個(gè)隨時(shí)間呈指數(shù)曲線下降的趨勢(shì)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在CACOCaco-2細(xì)胞內(nèi)存在P-pg對(duì)槲皮苷的外排作用，這也許可以解釋或部分解釋槲皮苷胞內(nèi)攝取呈指數(shù)曲線下降的趨勢(shì)特征，同時(shí)說明由P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥，在將藥物泵出的同時(shí)，也

29、會(huì)機(jī)制也會(huì)將進(jìn)入胞內(nèi)的槲皮苷泵出到腸腔，從而影響槲皮苷的腸道吸收（本句不通，不能說“. 機(jī)制影響.的吸收”）。但是，這一外排作用具有一個(gè)什么樣的時(shí)間依賴性，以及是否還存在其他的機(jī)制參與槲皮苷的外排或轉(zhuǎn)化，仍有待深入研究和探討。 另外， 槲皮苷對(duì)鈣黃綠素-AM細(xì)胞攝取的實(shí)驗(yàn)影響實(shí)驗(yàn)表明，槲皮苷是P-gp的抑制劑，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(3、9、27×103mg·L-1)與陽性抑制劑對(duì)照組比較對(duì)P-gp外排功能均表現(xiàn)出顯著的抑制作用（p值分別為0.023、0.002、0.005和0.010、0.001、0.001），說明槲皮苷同時(shí)也具有一定的改善腫瘤耐藥的作用。-抑制什么？。但是，該實(shí)驗(yàn)所

30、取得的結(jié)果仍有許多缺陷和不足，在槲皮苷的腸道吸收過程中是否存在乳糖根皮苷酶水解途徑、P-pg對(duì)槲皮苷的外排作用具有一個(gè)什么樣的時(shí)間依賴性、是否還存在其他的機(jī)制參與槲皮苷的外排或轉(zhuǎn)化、以及槲皮苷是通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合還是其他機(jī)制抑制P-gp的外排作用等，仍有待完善實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)后進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究和探討。 總之， 槲皮苷與P-gp在腸道吸收模型Caco-2細(xì)胞中的相互作用，為深入進(jìn)一步闡明槲皮苷對(duì)P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥的改善作用以及P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥對(duì)槲皮苷腸道吸收的抑制作用奠定了一個(gè)細(xì)胞水平營(yíng)養(yǎng)、藥物和疾病之間的關(guān)系奠定了一個(gè)初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開展研究疾病營(yíng)養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)與藥物在腫瘤

31、治療中的作用和意義和指導(dǎo)用藥開創(chuàng)了一個(gè)新思路。-結(jié)論較泛。應(yīng)就本文所得結(jié)果、結(jié)果之間相互聯(lián)系及其意義進(jìn)行分析得出結(jié)論。參考文獻(xiàn)1Scalbert A.,Johnson I.T., Saltmarsh M. Polyphenols: antioxidants and beyond.Am J Clin Nutr,2005,81(suppl):215s.2Djuv A,Nilsen OG.Caco-2 cell methodology and inhibition of the P-glycoprotein transport of digoxin by Aloe vera juice J.Phyt

32、other Res,2008,22(12):1623-1628.3Yang XW,Yang XD,Wang Y,et al.Establishment of Caco-2 cell monolayer model and standard operation procedure for assessing intestinal absorption of chemical components of traditional Chinese medicine J.Yi Jie He Xue Bao.2007;5(6):634-641.4von Richter O,Glavinas H, Krajcsi P,et al. A novel screening strategy to identify ABCB1 substrates and inhibitors J.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2009,379(1):11-26.5Tan W,Chen H,Zhao J,et al. A study of intestinal absorption of bicyclo