JISZ28012000抗菌制品抗菌性能的檢測與評價

1、日本國家標(biāo)準(zhǔn)JIS Z 2801:2000抗菌制品抗菌性能的檢測與評價引言本標(biāo)準(zhǔn)是為規(guī)范抗菌制品抗菌性能的評價方法制定的，并于1998 年 12 月在 “生活相關(guān)新型（抗菌）功能制品會議”的報告上公布的，（亦稱 “抗菌制品的指導(dǎo)方針”） 。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了作為抗菌制品重要性能之一的抗菌性能的測試方法?？咕破返钠渌匾阅?，包括安全性、性能持久性以及制品標(biāo)識則請參考“抗菌制品的指導(dǎo)方針”。1. 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了抗菌制品（包括中間制品）表面抗細(xì)菌活性及效果的測試方法。備注：本標(biāo)準(zhǔn)暫不包括抗菌制品的其他功能，如抗真菌性能和除臭性能。2. 規(guī)范性引用標(biāo)準(zhǔn)下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款

2、。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。JIS K 0950 滅菌塑料培養(yǎng)皿JIS K 0970 微量移液器JIS K 3800 二級生物安全柜JIS K 8101 乙醇（ 99.5）JIS K 8150 氯化鈉JIS K 8180 鹽酸JIS K 8263 瓊脂JIS K 8576 氫氧化鈉JIS K 9007 磷酸二氫鉀JIS K 9017 磷酸氫二鉀JIS L 1902 紡織品抗菌性能的檢測與評價JIS R 3505 玻璃量具3. 定義本標(biāo)準(zhǔn)中用到的主要術(shù)語定義如下：a）抗菌抑制制品表面細(xì)菌生長的狀態(tài)。b）抗菌整理為獲得抗菌效果而進(jìn)行的處理。c）抗菌制品 實施抗菌加工后的制品。

3、d）抗菌活性值 抗菌制品和未處理制品在接種細(xì)菌培養(yǎng)后，得到活菌數(shù)目對數(shù)的差值。 參考資料：JIS L 1902 的抑菌（靜菌）活性和本標(biāo)準(zhǔn)中的抗菌活性概念相同。e）抗菌效果根據(jù)抗菌活性值判定抗菌制品抗菌效果。4. 抗菌效果按本標(biāo)準(zhǔn)的測試方法，抗菌制品的抗菌活性值應(yīng)不小于2.0，超過2.0 的數(shù)值若取得各相關(guān)單位同意也可采用。5. 試驗方法5.1 紡織制品測試方法抗菌紡織制品的檢測方法根據(jù)JIS L 1902 : 8 （定量法）測定5.2 塑料等制品的測試方法適用于非紡織制品，如塑料制品、金屬制品、陶瓷制品等。根據(jù)纖維制品的形狀和用途也可采用5.1的方法測試。5.2.1 試驗菌種試驗所采用的菌種

4、見下，需采用下述細(xì)菌中的每一種：a）金黃色葡萄球菌b）大腸桿菌試驗所用菌株舉例如表1所示。如從有別于表1的機構(gòu)獲取菌株，則該機構(gòu)必須是國際菌種保藏中心（WFCC: World Federation of Culture Collection ）的成員或日本菌種保藏協(xié)會 （JSCC: Japan Society of Culture Collection ）的成員，并且菌株必須和表1 相同。表1試驗所用的菌株細(xì)菌種類菌株號保藏機構(gòu)金黃色葡萄球菌ATCC6538PFDA209PIFO 12732美國菌種保藏中心 美國食品藥品監(jiān)管局（FDA） 發(fā)酵研究所大腸桿菌ATCC 8739IFO 3972美國

5、菌種保藏中心 發(fā)酵研究所5.2.2化學(xué)試劑、材料和器材除非另有說明，本試驗方法所用的化學(xué)試劑、材料和器材如下所示。乙醇（C2H5OH）符合JIS K 8012規(guī)定的一級或更局牛肉膏微生物試驗用蛋白月東微生物試驗用氯化鈉符合 JIS K 8150純化水符合日本藥典第十三次修訂版要求瓊脂符合 JIS K 8263酵母浸膏微生物試驗用胰蛋白月東微生物試驗用葡萄糖微生物試驗用酪蛋白月東微生物試驗用大豆蛋白月東微生物試驗用卵磷脂微生物試驗用非離子表面活性劑聚山梨醇脂（吐溫 80）磷酸二氫鉀符合 JIS K 9007磷酸氫二鉀符合 JIS K 9017氫氧化鈉符合 JIS K 8576鹽酸符合 JIS K

6、 8180棉塞等棉制，或硅膠、金屬、莫頓塞等白金接種環(huán)端部直徑約為4mm環(huán)干熱火菌器可在 160-180 CX#蒸氣消毒鍋可保持121c并在103KMPa保壓安全柜符合JIS K 3800的規(guī)定潔凈臺微生物試驗用移液管符合或等同于JIS K 0970 或達(dá)到 JIS R 3505 中規(guī)定的A 級培養(yǎng)箱溫度控制精度 1 培養(yǎng)皿玻璃材質(zhì)，內(nèi)直徑90mm 或遵照 JIS K 0950 中 90A 或 90B 規(guī)定洗脫袋微生物試驗用Stomacher微生物試驗用薄膜不影響微生物生長并且不吸水的材料，厚度無明確規(guī)定，但要求附著性好5.2.3 滅菌方法a） 干熱滅菌放入干熱滅菌器在160-180 下滅菌3

7、0-60 分鐘注意：滅菌后，如果棉塞或包裝紙不小心被水弄濕，相關(guān)器皿請不要繼續(xù)使用。b） 高壓蒸汽滅菌在滅菌消毒鍋中注入水，將待滅菌的物品裝入筐中，并放于消毒鍋架子上，蓋緊，加熱，在121 或103Kpa 下保持 15-20 分鐘。停止加熱，然后使其自然冷卻到100以下，打開排氣閥放出蒸汽，打開蓋，取出滅菌物品。必要時放入潔凈臺或安全柜中冷卻。 為避免滅菌鍋受培養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)品污染，用中性洗滌劑洗滌滅菌鍋，并用水沖洗干凈。c） 火焰滅菌將待滅菌的物品置于由燃?xì)饣蚓凭紵a(chǎn)生的火焰上，如對于白金接種環(huán)應(yīng)加至紅熱，對于試管則在火焰上烤2-3 秒鐘。d） 器材準(zhǔn)備用堿性或中性洗滌劑洗刷試管、燒瓶等器

8、具，充分沖洗，干燥后干熱滅菌或蒸汽滅菌后使用。5.2.4 培養(yǎng)基等 養(yǎng)基等使用下列培養(yǎng)基，如商品培養(yǎng)基和此處介紹的培養(yǎng)基組成相同，則也可使用商品培養(yǎng)基。a） 營養(yǎng)肉湯將 3.0g 牛肉膏、 10.0g 蛋白胨、 5.0g 氯化鈉溶于1000ml 蒸餾水或去離子水中，放入錐瓶、混合、充分溶解后，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH 為 7.0-7.2（ 25） ，使用前，將其分別注入試管，加上棉塞，然后進(jìn)行高壓滅菌。若配好后不立即使用，要在 5c10c下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養(yǎng)基。b）營養(yǎng)瓊脂將5.0g牛肉膏、10.0g蛋白月東、5.0g氯化鈉和15.0g瓊脂，加入1000ml蒸儲水

9、或去離子水中，置入錐瓶、混合并放入沸水浴中充分溶解。用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH 為 7.0-7.2（ 25） ，加上棉塞，然后進(jìn)行高壓滅菌。若配好后不立即使用，要在 5c10c下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養(yǎng)基。c）平板計數(shù)瓊脂將2.5g酵母粉、5.0g胰蛋白月東、1.0g葡萄糖和15g瓊脂加入到1000ml蒸餾水或去離子水中，置于錐瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 為 7.0-7.2（ 25） ，加上棉塞，然后進(jìn)行高壓滅菌。若配好后不立即使用，要在 5c10c下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養(yǎng)基。d）斜面培養(yǎng)基將6-10ml加熱溶解

10、的營養(yǎng)瓊脂 b）注入試管，塞上棉塞并用高壓蒸汽法滅菌。滅菌后的試管在潔凈間中以和水平面成15傾角放置來讓其凝固。若配好后不立即使用，要在5C10c下保存。如沒有冷凝水出現(xiàn)，將其溶解，并凝固后使用。不要使用配制完存放一個月或以上的斜面培養(yǎng)基。e） SCDLP 肉湯 將 17.0g 酪蛋白胨、3.0g 大豆蛋白胨、5.0g 氯化鈉和2.5g 磷酸氫二鈉、2.5g葡萄糖和1.0g 卵磷脂加入到1000ml 蒸餾水或去離子水中，置于燒瓶，加7.0g 非離子表面活性劑以促進(jìn)溶解。用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為6.8-7.2 (25C).使用此培養(yǎng)基時，將其分散到試管中或燒瓶中，將棉塞塞上，然后用高

11、壓濕熱法滅菌。若配好后不立即使用，要在5c10c下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的SCDLP肉湯。f)磷酸鹽緩沖溶液將34.0g磷酸二氫鉀放入容量瓶中，加入 500ml蒸儲水或去離子水已將其充分溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為6.8-7.2(25 C),然后加入蒸儲水或去離子水將溶液定容到 1000ml。使用時，取部分溶液到試管或燒瓶中，塞上棉塞，并加入 7.0g 非離子表面活性劑。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為6.8-7.2 (25C)。使用此溶液時，將其分裝至試管或燒瓶中，塞上棉塞，然后用高壓濕熱法滅菌。若配好后不立即使用，要在 5c10c下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的磷

12、 酸鹽緩沖溶液。g)磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液用濃度為0.85%的氯化鈉溶液稀釋磷酸鹽緩沖溶液至體積比800倍。當(dāng)使用此溶液時將其分裝至試管或燒瓶中，塞上棉塞，然后用高壓濕熱法滅菌。若配好后不立即使用，要在 5c10c下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液。5.2.5 細(xì)菌的保藏在無菌條件下轉(zhuǎn)接試驗細(xì)菌，必要時要使用生物安全柜。一手同時拿著保 藏菌和5.2.4 d)的待接種斜面培養(yǎng)基，另一手拿接種環(huán)，并用拿接種環(huán)的手拔開試管的橡膠 塞。在火焰上對試管口滅菌，并對接種環(huán)滅菌，然后將接種環(huán)的頭部放入斜面培養(yǎng)基的冷凝水中冷卻。用接種環(huán)從細(xì)菌生長面上刮下細(xì)菌，并用劃線法接種到斜面培

13、養(yǎng)基上。用火焰再次對試管口部進(jìn)行消毒并塞上棉塞。用火焰對接種環(huán)進(jìn)行消毒。在351C下對接種后的斜面進(jìn)行24-48小時培養(yǎng)，然后在 5-10C保藏。一個月內(nèi)將其接種到新的斜面(以此類推)，但接種次數(shù)從菌種中心得到的細(xì)菌算起不應(yīng)超過10代。如保存時間達(dá)到或超過一個月，不可進(jìn)行繼代培養(yǎng)。備注：如圖1將接種環(huán)端部插入冷凝水中分散細(xì)菌，用接種環(huán)從底部拉一條線到上部,或?qū)⒔臃N環(huán)再次插入到冷凝水中畫一條折線到頂端。注意：如細(xì)菌保藏機關(guān)提供的細(xì)菌經(jīng)過凍干法或冷凍法用于長時間保存，從原始保存 菌制備保藏細(xì)菌的次數(shù)也應(yīng)包括在細(xì)菌培養(yǎng)代數(shù)之內(nèi)。如使用此保藏菌株，則其繼代培養(yǎng)次數(shù)不應(yīng)超過10減去保藏菌的代數(shù)。5.2.

14、6 試驗操作 細(xì)菌操作必須在無菌條件下進(jìn)行，試驗菌注意不能對試驗操作人員、設(shè)備和環(huán)境構(gòu)成污染，如有需要則使用生物安全柜。a）細(xì)菌前培養(yǎng) 用接種環(huán)從5.2.5的保藏細(xì)菌的培養(yǎng)基中取1環(huán)細(xì)菌接種到5.2.4 d）的斜面培養(yǎng)基上，35 1 條件下培養(yǎng)16-24 小時。從這一培養(yǎng)物上，再取一環(huán)細(xì)菌到新的斜面培養(yǎng)基上，35 1 條件下培養(yǎng)16-20 小時。b）樣片準(zhǔn)備 從制品上切取邊長為502mm,厚度不大于10mm3的方塊，作為標(biāo)準(zhǔn)樣片?？瞻讓φ諛? 6 塊 5、抗菌樣片3 塊。如不能得到空白對照樣，則利用5.2.2 的薄膜。密切注意樣片和樣片制備過程中的微生物污染以及制品的污物污染。最好從制品上采集

15、樣片，如由于制品的形狀的原因不能從制品采集樣片，則利用相同的原料和工藝單獨制備 樣片。備注：3如難以或不能將制品切成50+2mm,厚度不大于10mm的方塊，也可采用非標(biāo)準(zhǔn)形狀和尺寸的樣片，這一樣片應(yīng)該可以在其上覆蓋400-1600mm 2的薄膜。4從空白樣或薄膜制得的樣片。5 6 個未抗菌處理樣片中，3 個用于接種后零時間記數(shù)，另外3 個用于接種后培養(yǎng)24小時后記數(shù)。c）樣片清洗 用紗布或脫脂棉蘸酒精輕輕擦拭b）中樣片2-3次，并干燥徹底。若上述處理會導(dǎo)致樣片軟化、樣片表面涂層溶解及組分溶出等現(xiàn)象，則認(rèn)為此種處理將影響試驗結(jié)果，可采用其他方法處理或直接試驗而不進(jìn)行任何處理。d）接種菌液的制備

16、將5.2.4 a）的營養(yǎng)肉湯稀釋 500倍，用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié) pH至6.8-7.2，然后高壓滅菌，作為 1/500NB。將a）中的前培養(yǎng)物取1環(huán)均勻分散到少量 的 1/500NB 中， 采用顯微鏡觀察法或其它合適的方法估計細(xì)菌數(shù)目，并用 1/500NB 稀釋菌液至細(xì)菌濃度為（2.510）M05cfu/ml,以此作為試驗用菌液。若菌液不立即使用，將其 冷凍至0，保存時間不超過4 小時。e）試驗菌液的接種將c）中的樣片放入滅菌培養(yǎng)皿中，保持試驗面朝上6 ,用移液管7準(zhǔn)確量取d）中的菌液0.4ml,緩慢滴到每個樣片表面。并將薄膜蓋于菌液上，調(diào)節(jié)薄膜使菌液分散到整個薄膜，注意不要使菌液從薄

17、膜邊溢出，然后蓋上培養(yǎng)皿的上蓋。備注：6 試驗面必須為制品的抗菌加工面，即使抗菌加工達(dá)到制品的一定深度，也不能采用制品的橫切面。7 若采用標(biāo)準(zhǔn)尺寸以外的樣片，則所加菌液量根據(jù)該樣片所用薄膜的尺寸按比例減少。即使對于符合標(biāo)準(zhǔn)尺寸的樣片，如按規(guī)定量接種時，由于某些材料如陶瓷、玻璃、瓷磚、搪瓷等的親水性好，難免因培養(yǎng)皿稍微傾斜而導(dǎo)致培養(yǎng)液流出。此種情況下，接種菌液量減為規(guī)定菌液量的1/4。 但即使菌液量減少也要保證每片上的細(xì)菌數(shù)為（ 1.0-4.0）X105cfu/ml ,此種情況下，d）中規(guī)定的菌液濃度不能滿足要求，而必須根據(jù)具體要求配制。8薄膜的標(biāo)準(zhǔn)尺寸為40i2mmo若樣片為非標(biāo)準(zhǔn)尺寸，則調(diào)整

18、薄膜尺寸，以使薄膜邊緣距樣片邊緣2.5mm以上，但薄膜尺寸不應(yīng)小于400mm2。在制品由于形狀難以將薄膜密著于樣片表面，以及由于表面吸水或親水，不使用薄膜菌液也可在樣片表面鋪展這二種情況下可不用薄膜。f） 接種后樣片的培養(yǎng)將接種后放置3個抗菌樣片和3個空白無加工樣片的培養(yǎng)皿，在 35 1相對濕度不小于90%的條件下培養(yǎng)24小時。參考資料：此時制品的抗菌性能是在該培養(yǎng)溫度下的抗菌活性值，但也可同時考慮抗菌 材料的使用溫度（如室溫）下的抗菌性能。g）培養(yǎng)后樣片的洗脫1） 0接觸時間的樣片的洗脫9 對 3個 0 接觸時間的空白對照樣，將覆蓋膜和樣片用鑷子小心放入Stomacher袋以防止菌液損失，用

19、移液管取 5.2.4 e）中10ml SCDLP加入到Stomacher 袋中，并用手或分離器充分搓揉樣片和薄膜。洗脫后馬上對洗脫液進(jìn)行活菌 計數(shù)。2）培養(yǎng)后試驗片的洗脫9對f）中的培養(yǎng)后樣片的洗脫采用類似1）的方法進(jìn)行，之后馬上對洗脫液進(jìn)行活菌計數(shù)。9 對于細(xì)菌洗脫，如有其他方法效果與此種方法相當(dāng)或優(yōu)于此方法，也可采用。如因為樣片尺寸以及其他性能方面的原因，用 10ml SCDLP 難以洗脫，也可增加SCDLP用量。h）傾注活菌計數(shù)法 用移液管準(zhǔn)確量取 g）的洗脫液1ml,放于裝有9.0ml 5.2.4 g）中的磷酸鹽生理鹽水緩沖液的試管中，充分混勻。用新的移液管從中量取1ml 到另一支試管

20、中并混勻。重復(fù)上述10倍梯度稀釋過程。從洗脫液及其稀釋液中分別取1ml,各放入2個滅菌培養(yǎng)皿中，向各培養(yǎng)皿中傾入15-20ml溫度為46-48 C的5.2.4 c）中的平板計數(shù)瓊脂，與菌液混和充分。蓋上上蓋，允許在室溫放置。待瓊脂凝固后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，并在35 1 培養(yǎng) 40-48 小時。培養(yǎng)后，計算菌落數(shù)為30-300 的培養(yǎng)皿，若1ml 洗脫液中的細(xì)菌數(shù)小于30,則對該培養(yǎng)皿直接計數(shù)。如任何培養(yǎng)皿中均沒有菌落，則記錄為V1。如果細(xì)菌數(shù)和稀釋比例不成反比，則要考慮由于抗菌劑的作用而影響了菌落的形成，這樣就需要使用中和劑或稀釋等方法使抗菌劑不對菌落形成產(chǎn)生影響的方法來培養(yǎng)計數(shù)。參考資料：本規(guī)定以外采集的菌落數(shù)的計算方法，可參考日本藥學(xué)會編的衛(wèi)生試驗法注解（ 2000） 1.2 微生物試驗法3）菌數(shù)測定（1）傾注平板試驗法，或衛(wèi)生福利部生活衛(wèi)生局監(jiān)制修訂的食品安全規(guī)則的2 有害指示菌1.標(biāo)準(zhǔn)分析方法中的總菌數(shù)測定。5.2.7 活菌數(shù)計算根據(jù)式（1） ，由菌落計數(shù)的得到活菌數(shù)。N=CX DXV（1）其中N: 每樣片的活菌數(shù)C: 菌落數(shù)（2 個培養(yǎng)皿的平均值）D: 稀釋倍數(shù)V:用于洗脫的SCDLP培養(yǎng)液白體積（ml）記錄活菌數(shù)時取二位有效數(shù)字，第三位有效數(shù)字四舍五入。在V=10 的情況下，對菌落數(shù)小于 1 的情況記為小于10。取活菌數(shù)的平