生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)_scy-3_共聚焦激光掃描(熒光)顯微鏡20151125

1、共聚焦顯微技術(shù)共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)人眼分辨率：人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25m25mm共焦顯微鏡分辨率：共焦顯微鏡分辨率：0.18m mm電子顯微鏡分辨率：電子顯微鏡分辨率：0.2nm共聚焦激光掃描（熒光）顯微鏡共聚焦激光掃描（熒光）顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品，是當(dāng)今世界最先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。激光共聚焦顯微鏡利用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦的原理和裝置，

2、以及通過(guò)針孔的選擇和PMT的收集，并帶有一套對(duì)其所觀察到的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖像分析處理的系統(tǒng)軟件。與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，它具有更高的分辨率，實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點(diǎn)。所以它問(wèn)世以來(lái)在生物學(xué)的研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。 ObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserEmission PinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterConfocal PrincipleConfo

3、cal Principle照明針孔照明針孔探測(cè)針孔探測(cè)針孔二色鏡或分光鏡二色鏡或分光鏡激光光源激光光源共聚焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)減少由于光散射產(chǎn)生的圖像模糊增加有效分辨率提高信噪比厚標(biāo)本的清楚細(xì)查Z軸掃描可以實(shí)現(xiàn)數(shù)字放大倍率的調(diào)節(jié)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片conventional

4、confocal激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別3. 增加側(cè)向分辨率增加側(cè)向分辨率d2alconventionconfocaldd激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別4. 由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)三三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):1.點(diǎn)照明點(diǎn)照明2.具有照明具有照明pinhole和探測(cè)和探測(cè)pinhole3.照明照明pinhole和探測(cè)和探測(cè)pinh

5、ole共軛共軛(共焦共焦), 共焦點(diǎn)共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)具有掃描系統(tǒng) 逐點(diǎn)掃描成像逐點(diǎn)掃描成像 5.具有多個(gè)（四個(gè)）具有多個(gè)（四個(gè)） 熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物被標(biāo)記物 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)技術(shù)指標(biāo)（技術(shù)指標(biāo)（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x 傳統(tǒng)顯微鏡傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61 /NA （0.25 m mm ) Confocal: Rxy=0.4 /NA（0.18 m mm )2. 樣品的最大厚

6、度樣品的最大厚度: 取決于取決于: 物鏡的物鏡的NA、物鏡的工作距離、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度激光的穿透力、樣品的透明度 Z軸的最大移動(dòng)范圍軸的最大移動(dòng)范圍(166m mm、Z-wide)3. 樣品的最小光切厚度樣品的最小光切厚度: (載物臺(tái)最小移動(dòng)距離為載物臺(tái)最小移動(dòng)距離為40nm） 取決于取決于: 物鏡的物鏡的NA、針孔大小、針孔大小 Z軸的最小移動(dòng)步距軸的最小移動(dòng)步距: 40nm Z軸的分辨率軸的分辨率: 0.35 m mm 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)4. 激光器激光器 Ar激光器激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreN

7、e : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器激光器(UV): 361nm 激光器的特點(diǎn)激光器的特點(diǎn): 1) 方向性好方向性好: 激光基本延直線傳播激光基本延直線傳播 2) 單色性好單色性好 :=10-8nm 3) 高亮度高亮度: 激光方向性好激光方向性好, 其在空間上的能量分布是高度其在空間上的能量分布是高度 集中的。集中的。 4) 偏振性偏振性: 激光為平面偏振光激光為平面偏振光, 光纖耦合光纖耦合激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)5. 四個(gè)熒光通道四個(gè)熒光通道, 一個(gè)透射光通道一個(gè)透射光通道 即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時(shí)采

8、集透射光圖像還可以同時(shí)采集透射光圖像,但透射光但透射光圖像為圖像為非共焦圖像非共焦圖像。 是共聚焦顯微鏡最基本的功能 可來(lái)自單標(biāo)和多標(biāo)樣本 往往采用固定后的組織或細(xì)胞標(biāo)本；活細(xì)胞也可進(jìn)行特定時(shí)間點(diǎn)的單張光學(xué)切片1 單張光學(xué)切片功能vestigial apterousCiD (cyanine 5). Not just the structure of a single cell, the relationship of adjacent cells at different plane can also be viewed clearly like below: 可用于活細(xì)胞或固定細(xì)胞的觀察、分

9、析2 2 細(xì)胞顯像細(xì)胞顯像CriteriaFixed CellsLiving CellsLimits of illuminationFading of fluorophorePhototoxicity and fading of dyeAntifade reagentPhenylenediamine, etc.NONE!MountantGlycerol (n = 1.51)Water (n = 1.33)Highest NA lens1.41.2Time per imageUnlimitedLimited by speed of phenomenon;light sensitivity of

10、specimenSignal averagingYesNoResolutionWave opticsPhoton statisticsHertel L.A., Stricker S.A. and Loker E.S. 2000. Calcium dynamics of hemocytes of the gastropod Biomphalaria glabrata: effects of digenetic trematodes and selected bioactive compounds. Invertebrate Biology, v. 119(#1): 27-37. 腹足綱一種淡水螺Biomphalaria gla