小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)

1、以下培養(yǎng)針對于小鼠的 R1 胚胎干細胞 系，其它 胚胎干細胞 的培養(yǎng)可以參考。 不過人的胚胎 干細胞培養(yǎng) 不可以采用下面的 protocol ，需要用專用的 protocol 和培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)維持 ES 細胞處于未分化狀態(tài)ES細胞培養(yǎng)用含有LIF 白血病抑制因子和Feed細胞的培養(yǎng)基高糖來阻止細胞的分 化。為細胞提供包被有明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。 建議每 23 天從到達 80 90 融合的平板按 1：8 的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在明膠包被的培 養(yǎng)皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2 個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置

2、于37C, 5% C02 ,100%濕度條件下培養(yǎng)。如果在Feed細胞，那么就需要采用 MMC進行處理，抑制Feed細胞增殖，但仍然能保持其 分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及 Feed細胞。Feed細胞可以來源于 STO細胞或原代胚 胎成纖維細胞。培養(yǎng)基ES:配制一 20X不含DMEM , HS , LIF的溶液該溶液也能用于 EB培養(yǎng)基見下文。分裝 在50ml離心管中，稀釋為 2X,每管42ml，貯存在-20 C。通過將21ml該溶液，HS和 LIF參加450ml DMEM 中制備培養(yǎng)基，0.22卩濾膜過濾。貯存于4C,時間不要超過2周。貯存液DMEM (高糖) 馬血清( HS)L-谷氨

3、酰胺(200mM )MEM NEAA (10mM) HEPES(1M)3巰基乙醇(55Mm )PESTLIF復蘇細胞細胞被凍存在10%二甲基亞砜DMSO 中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細胞。然 而,二甲基亞砜對細胞有毒性,快速的進行細胞復蘇是很重要的。步驟：1從液氮中取出一管細胞；2將凍存管置于37C水浴中2分鐘或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解； 3將細胞轉(zhuǎn)移到一 15ml Falcon 管中；4參加 5ml ES 培 養(yǎng)基 用培養(yǎng)基沖洗凍存管；5離心 3分鐘；6棄上清,用 2ml ES 培養(yǎng)基重懸細胞,至少吹打 10次； 7接種在明膠包被見下文的 6 孔或 6cm 組織培養(yǎng)皿； 8孵育。凍存細

4、胞 凍存液90HS 和 10DMSO步驟：1. 1 XPBS洗細胞并留少許 PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；2用細胞刮刀收集細胞；3. 將細胞轉(zhuǎn)入 15ml 離心管管內(nèi)并離心 3 分鐘；4. 棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中10 cm 的培養(yǎng)皿用 2ml，15cm 的培養(yǎng)皿用 6 7ml。5. 分裝于凍存管內(nèi)，每管 1ml ；6. 置80 C過夜，第二天移入液氮。Geltin 明膠包被 準備 geltin 溶液1. 將0.5 g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中50 65C水浴1530分鐘。2. 最好在溶液沒有冷卻的情況下通過0.22卩濾膜過濾，貯存在 4C。 包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿1. 參加足量的明膠溶液

5、覆蓋培養(yǎng)平面15 cm培養(yǎng)皿加2ml, 10 cm培養(yǎng)皿加1 ml，溶液 的量并不重要，只要能完全覆蓋培養(yǎng)外表就行了。；2. 置室溫 30 分鐘；3. 去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平放或倒扣，以免明膠 污染蓋子和流出培養(yǎng)板。細胞傳代建議每 2 天傳代細胞一次， 過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率， 我們建立了一種純化 方法來去除分化細胞， 在將細胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前， 通過將分化細胞黏附在沒 有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。1 .去除培養(yǎng)液；2. 無鈣鎂 PBS Gibco 洗滌；3. 參加胰酶 EDTA Gibco 。37

6、 C孵育5分鐘。4. 參加 ES 培養(yǎng)基使胰酶失活；5. 將細胞轉(zhuǎn)入 15 ml 離心管中離心 3min；6. 去除上清，將細胞重懸于2 ml ES 培養(yǎng)基，至少吹打 1020次。如果參加培養(yǎng)基的量較少會比擬容易將細胞團弄散分開。ES細胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細將細胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細胞的自然分化。7. 將細胞接種在沒有包被的組織培養(yǎng)皿中使用和一開始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿放入溫箱2 小時分化細胞在該時間內(nèi)將黏附，而 ES 細胞仍將保持懸??；8. 將含有細胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入geltin 包被的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細胞被分散開前面已 經(jīng)提到 ES 細胞有聚集成團的傾向9. 建議按 1

7、：41：10的比率傳代ATCC保持細胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗，1：8 的比率是好的，可以使細胞的自然分化降到最低。當你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進行細胞傳代可以使用表1 來計算傳代比率。體外分化 胚胎干細胞在體內(nèi)外可以分化為各種類型的細胞。 我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細胞 通過在最少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇第 3 步，在有 bFGF 存在的情況下擴增第 4 步并最終 分化在第5步。細胞全程培養(yǎng)在 37C, 5% C02 ,100%濕度條件下。一般體外誘導向神經(jīng) 細胞方向分化，也可以采用低濃度的 RA 進行誘導。時間線總時間為 2734天第2步；41天第 3步；410天第 4步；4天 第5步；1

8、015天 體外向心肌細胞方向分化胚胎干細胞在體外去除 LIF 情況下會自然向心肌細胞方向分化,小鼠的 R1 系一般在第 7-8 天自然出現(xiàn)搏動的心肌細胞,與胚胎發(fā)育時間線是完全一致的。培養(yǎng)基EB配制一 20X不含DMEM , FBS, LIF的溶液該溶液也能用于 ES培養(yǎng)基見前述。分 裝在50ml離心管中，稀釋為2X,每管42ml,貯存在-20 C。將21ml該溶液和50ml FBS 參加450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，濾膜過濾。貯存于 4 C。貯存液DMEM 高糖胎牛血清L-谷氨酰胺200mM MEM NEAA 10mMHEPES1M3巰基乙醇55Mm PEST P104U/mlS104 卩

9、 g/mlITSFn a nd N3 分化培養(yǎng)基：配制一 20X不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml離心管中，稀釋為 1 X,，濾膜過 濾，貯存在-20C。將該溶液參加 DMEM/F12中制備培養(yǎng)基，貯存于4C。貯存液DMEM 高糖轉(zhuǎn)鐵蛋白 50mg/ml胰島素 5mg/ml亞硒酸鈉300訕黃體酮20訕腐胺100訕PEST P104U/ml S104 卩 g伽I層粘連蛋白100卩g/ml纖維連接蛋白250卩g/ml堿性 rhFGF, 10 卩 g/ml*在第 4 步將 bFGF 參加 N3 培養(yǎng)基使終濃度為 10ng/ml。ITSFn a nd N3 培養(yǎng)基貯存液的準備 使用無菌的溶劑和

10、稀釋液, 在分裝之前要對溶液進行過濾, 如果因為某些原因溶液在分裝之 前沒有進行過濾,需要在管子上標明以便別人在使用時知道該溶液不能直接用于細胞培養(yǎng) 。貯存液 溶劑,貯存液,稀釋劑和儲存轉(zhuǎn)鐵蛋白 50mg/ml胰島素 5mg/ml亞硒酸鈉300訕黃體酮20 口M腐胺100MPEST P104U/ml S104 卩 g伽I層粘連蛋白100卩g/m纖維連接蛋白250卩g/ml 堿性 rhFGF, 10 卩 g/m包被有多聚鳥氨酸 /纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板使用或不使用蓋玻片包被液的準備多聚-L-賴氨酸，15卩g/ml把75ml多聚-L-賴氨酸和425ml 1沖BS混合。貯存在 4C。纖維結(jié)合蛋白，1卩

11、g/ml把纖維結(jié)合蛋白和 500ml 1 >PBS混合。包被過程：1. 參加多聚-L-賴氨酸，至少2 3小時過夜也行2. 吸出多聚-L-賴氨酸3. 參加纖維結(jié)合蛋白，大約12小時4. 吸出纖維結(jié)合蛋白，放置30分鐘晾干5. 貯存在4C24孔板用200卩,1 6孔板用500卩。1震蕩培養(yǎng)板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養(yǎng)孔。有時需 要劇烈震蕩培養(yǎng)板。體外分化方法第 1 步： ES 培養(yǎng)基在 LIF 存在的條件下維持細胞培養(yǎng)第 2 步： EB 培養(yǎng)基使用細菌培養(yǎng)皿去除 LIF 后胚狀體的形成需要 4天。1 .分散純化細胞參見上面的細胞傳代局部2. 純化 2 小時后將細胞轉(zhuǎn)入含有 ES 培養(yǎng)基的

12、50ml Falcon 管中，計數(shù)細胞取適量體積放入 15ml 管中離心 3 分鐘。3. 用 2mlEB 培養(yǎng)基重懸細胞，吹打至少1 0次制成單細胞懸液4. 一個15cm的細菌培養(yǎng)皿接種 45>06個細胞1個完全融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接 種 4 個同樣規(guī)格的細菌培養(yǎng)皿。5. 2 天后更換培養(yǎng)基將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置 35分鐘使細胞沉降。棄去上清，將細胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并 接種在新的細菌培養(yǎng)皿中。6. 用 EB 培養(yǎng)基培養(yǎng)的第 4天將細胞轉(zhuǎn)入沒有包被的組織培養(yǎng)皿中這即是細胞的移植步 驟。 1個組織培養(yǎng)皿之中放置 1個細菌培養(yǎng)皿，在進行第 3 步之前一天將胚狀體黏附在同 樣規(guī)格的培養(yǎng)板上

13、。形成胚狀體需要 4 天時間。在 EB 培養(yǎng)基中再培養(yǎng) 1 天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的外表。 這一天被認為是第 2 步和第 3 步的分界。第 3 步 ITSFn 培養(yǎng)基 在最少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細胞 1在胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn 培養(yǎng)基2并非所有胚狀體在這一時期都已經(jīng)發(fā)生粘附，因此在移除培養(yǎng)基時要小心謹慎以使大部 分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。3保持細胞在 ITSFn 中培養(yǎng)大約 10 天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基大約每隔一天。 觀察細胞形態(tài)， 神經(jīng)樣細胞大約出現(xiàn)在第 4 到第 7 天。當神經(jīng)樣細胞能夠被鑒別時， 轉(zhuǎn)入到 第 4 步。步驟的轉(zhuǎn)換應該在神經(jīng)前體細胞出現(xiàn)第一個清晰

14、的標志幾天以后，通常是在第 3 步的第 6 到第 10 天。第 4 步 N3 培養(yǎng)基 bFGF通過將神經(jīng)前體細胞培養(yǎng)在含有10ng/ml bFGF 的培養(yǎng)基中進行擴增。洗滌，參加 1-2ml 胰酶2. 37C孵育5分鐘3. 用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活性，將細胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置35分鐘移出細胞團，將上 清移入一新的離心管離心。4. 將細胞重懸于含有 bFGF 的 N3 培 養(yǎng)基。5 .將細胞接種在包被多聚 -L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或 6孔培養(yǎng)板， 6孔培養(yǎng)板中每孔放置 5個蓋玻片如果是塑料的放置 4個，以使最大可 能的獲得樣品數(shù)量。 24孔板接種3.5

15、>105/孔或6孔板1.7 >106/孔。6. 2 天后更換培養(yǎng)基第 5 步 N3 培養(yǎng)基通過撤除 bFGF 使神經(jīng)前體細胞分化1 .細胞被接種在蓋玻片上 4 天后將培養(yǎng)基換成不含 bFGF 的 N3 培養(yǎng)基2. 根據(jù)需要換液大約每隔一天3. 分化 10 15 天后固定細胞移除培養(yǎng)基PBS 洗滌參加 4%福爾馬林室溫放置 30 分鐘PBS 洗滌 2 次儲存于PBS。長期儲存使用含疊氮化納的PBS移植細胞的準備細胞在胚狀體形成 4天以后被移植相應于體外分化過程中的第 2步末細胞被轉(zhuǎn)種到組織培 養(yǎng)板 。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前 4天開始形成胚狀體。 通常再需要一天 時間以

16、便將胚狀體移植入一 10cm 的培養(yǎng)皿。移植1將胚狀體轉(zhuǎn)移至一 15ml圓錐形管中放置 35分鐘使胚狀體沉降下來。細胞被離心 3 分鐘會更好。 放置使之沉降將會去除更多的單個細胞 包括死細胞 而這些細 胞可以被離心下來。2.去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1沖BS中3離心 3分鐘4. 去除上清參加1胰酶10cm的培養(yǎng)皿加1ml5. 37C水浴5分鐘6. 參加 5mlEB 培養(yǎng)基小心吹打約 10次 小心處理細胞很重要，進行細胞傳代分散細胞時不可劇烈吹打。7. 離心 2分鐘&吸出上清將細胞重懸于 500卩I EB培養(yǎng)基9. 用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次10. 離心 2 次11 .吸出上清將細胞重懸于100卩I EB培養(yǎng)基煙酸己可堿標記ES細胞進行移植1. 準備