細(xì)胞凍存、解凍方法與細(xì)胞計(jì)數(shù)

1、細(xì)胞凍存、解凍方法與細(xì)胞計(jì)數(shù)一、細(xì)胞冷凍保存1.材料：生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO(Sigma D-2650、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene5000-0020、0.4（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII2、冷凍保存方法：（1）傳統(tǒng)方法: 冷存管置于410分鐘->-2030分鐘->-801618小時(shí)(或隔夜->液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20不可超過1小時(shí)，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程

2、序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1-3/分鐘之速度由室溫降至（-80以下）-120，再放在液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。3、步驟：（1）冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基，使細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。（3）離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。（4）取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，并晃動(dòng)試管，制成細(xì)胞凍存懸液（D

3、MSO最后濃度為510），使細(xì)胞濃度為15×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，12ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。4、注意事項(xiàng)：（1）欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(logphase且存活率高之狀態(tài)，約為8090致密度。冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。（2）細(xì)胞在液氮中可長(zhǎng)期凍存無限時(shí)間，而不會(huì)影響細(xì)胞活力；在-70度可保存數(shù)月。（3）注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無菌且無色(以0.22micronFGL

4、PTelflon過濾或是直接購(gòu)買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650，以510ml小體積分裝，4避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時(shí)釋放的熱量對(duì)細(xì)胞的損傷。緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲，可降低細(xì)胞受損。DMSO可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化，可換用10%甘油凍存。（4）冷凍保存之細(xì)胞濃度：normal human fibroblast:13×106cells/mlhybridoma:13×106cells/ml，細(xì)胞濃

5、度不要太高，某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。adherent tumor lines:57×106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需13×106cells/mlother suspensions:510×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。（5）冷凍保護(hù)劑濃度為5或10DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。（6）凍存可用10%90%的血清，一般高濃度血清

6、有助于維護(hù)細(xì)胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積（4度時(shí)），復(fù)蘇存活率在80%90%以上，對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞，以90%血清凍存更為有效。二、冷凍細(xì)胞活化1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。2、細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì)。3、材料37恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器4、步驟：（1）操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉。（3）將新鮮

7、培養(yǎng)基置于37水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。（4）取出冷凍管，立即放入37水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。（5）取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:101:15，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。（6）解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新

8、鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試1、原理：（1）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。（2）血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。（3）存活測(cè)試之步驟為dyeexc

9、lusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開始攝取染料；因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythro

10、sin bluish(SigmaE-9259及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647溶于100mlCa+/Mg+freesaline；血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip；計(jì)數(shù)器(counter；低倍倒立顯微鏡；粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics。白細(xì)胞稀釋液（4%乙酸溶液）。3、步驟：（1）取50l細(xì)胞懸浮液與50l trypan blue(orErythrosinbluish等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。（2）取少許混合液(約15l自血球計(jì)數(shù)盤ch

11、amber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosin bluish。（3）計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合，最后乘以104，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞。注：4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細(xì)胞數(shù)/ml；每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，最適濃度為510×105細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。5、范例：活細(xì)胞數(shù)/方格：5