CRISPRCas9系統(tǒng)工作原理

1、 CRISPR/Cas9系統(tǒng)系統(tǒng)第三小組第三小組 找資料：李瑤找資料：李瑤 王辰尹王辰尹 鄭小云鄭小云 整理資料：王桂玉整理資料：王桂玉 段林菲段林菲 劉成鳳劉成鳳 PPT PPT制作：張龍制作：張龍 勉惠勉惠 龍歡龍歡 匯報(bào)：辛國(guó)琴匯報(bào)：辛國(guó)琴目錄1簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 作用作用過(guò)程過(guò)程 應(yīng)用應(yīng)用與前景與前景32一、簡(jiǎn)介一、簡(jiǎn)介 1、引入：、引入： 基因定點(diǎn)修飾基因定點(diǎn)修飾是研究基因功能的重要手段之一也可被用于人類遺傳性疾病的治療，因此這類技術(shù)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。早期僅基于同源重組的基因打靶技術(shù)效率極低效率極低，應(yīng)用受到限制。直到人工核酸內(nèi)切酶出現(xiàn)人工核酸內(nèi)切酶出現(xiàn)，將這一現(xiàn)狀徹底改變。一、簡(jiǎn)

2、介一、簡(jiǎn)介 2、簡(jiǎn)介：、簡(jiǎn)介： 人工核酸酶的原理是一樣的，都是由DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶融合而成。 2013年初，一種全新的人工核酸內(nèi)切酶 CRISPR/Cas9 它主要是基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，其特點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單、成本低、作用高效。一、簡(jiǎn)介一、簡(jiǎn)介CRISPR全名：全名：clustered regularly interspaced short palindromic repeats 即成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，是基因組中一個(gè)含有多個(gè)短重復(fù)序列的位點(diǎn)，這種位點(diǎn)在細(xì)菌和古細(xì)菌胞內(nèi)起到了一種獲得性免疫（acquired immunity）的作用。CRISPR系統(tǒng)主要依賴cr

3、RNA和tracrRNA來(lái)對(duì)外源DNA進(jìn)行序列特異性降解。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種 CRISPR/Cas系統(tǒng)， TypeI，TypeII，Type3 ，其中TypeII系統(tǒng)是目前改造最為成功的人工核酸酶，因?yàn)槠渲恍枰粋€(gè)Cas9蛋白就能夠發(fā)揮CRISPR系統(tǒng)的免疫作用3、該、該系統(tǒng)系統(tǒng)的工作的工作原理原理：crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。一、簡(jiǎn)介一、簡(jiǎn)介一、簡(jiǎn)介一、簡(jiǎn)介二

4、、作用二、作用過(guò)程過(guò)程獲得獲得CRISPR的間隔的間隔區(qū)區(qū)CRIPSR基因座的表基因座的表達(dá)與達(dá)與crRNA 的成熟的成熟CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)系統(tǒng)對(duì)外源遺傳物質(zhì)的切割外源遺傳物質(zhì)的切割二、作用過(guò)程二、作用過(guò)程 獲得獲得CRISPR的的間隔區(qū)間隔區(qū) 細(xì)菌通過(guò)將入侵的噬菌體或質(zhì)粒的一小段DNA序列整合到自身基因組的重復(fù)序列之間，即CRISPR 5端的兩個(gè)重復(fù)序列之間，從而獲得高度可變的間隔區(qū)域 因此，CRISPR基因座中的間隔序列從5到3的排列也記錄了外源遺傳物質(zhì)入侵的時(shí)間順序。 噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對(duì)應(yīng)的序列被稱為protospacer，通常protospacer的5或是3端延伸幾個(gè)

5、堿基序列很保守，被稱為PAM，它的長(zhǎng)度一般為25堿基，一般與protospacer相隔14堿基。二、作用過(guò)程二、作用過(guò)程 CRIPSR基因座的表達(dá)與基因座的表達(dá)與crRNA 的成熟的成熟 CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體前體CRISPR RNA，然后在Cas9和核酸酶的作用下被剪切成成熟的成熟的crRNA基因座基因座結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)相對(duì)的基因座結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單 以產(chǎn)膿鏈球菌的典型TypeIICRISPR/Cas為例5端 tracrRNA基因中間 一系列Cas蛋 白 編 碼 基 因3端 CRISPR基因座二、作用過(guò)程二、作用過(guò)程 CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)外源遺傳物質(zhì)

6、的切割系統(tǒng)對(duì)外源遺傳物質(zhì)的切割 成熟的tracrRNA、crRNA和Cas9形成核糖核蛋白復(fù)合物，crRNA識(shí)別外源匹配的DNA序列并與之結(jié)合，從而介導(dǎo)核糖核蛋白復(fù)合物對(duì)外源遺傳物質(zhì)的切割.三三、應(yīng)用與前景、應(yīng)用與前景雖然CRISPR/Cas的研究還處于初始階段，但是其已經(jīng)被應(yīng)用在工業(yè)、學(xué)術(shù)和醫(yī)療領(lǐng)域。 工業(yè)工業(yè)上：上：利用該系統(tǒng)構(gòu)建出具有噬菌體抗性的菌株以提高奶制品發(fā)酵的產(chǎn)量。也能把它的這種特性用于菌株分類，以及防止某些特殊質(zhì)粒的擴(kuò)散，防止基因污染，以保存菌株。 研究研究上：上：CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅可以用來(lái)進(jìn)行基因敲除，還可以敲入基因?？梢栽贑RISPR/Cas系統(tǒng)切割目的基因的同時(shí)

7、，通過(guò)同源重組修復(fù)斷點(diǎn)的原理引入特定突變或者插入目的基因片段。該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于細(xì)菌、斑馬 魚、果蠅、線蟲、酵母、小鼠、人類細(xì)胞以及水稻等。 醫(yī)療上：醫(yī)療上：還可以用在細(xì)胞水平建立疾病模型，治療遺傳疾病以及進(jìn)行細(xì)胞替代治療。HIV-1病毒有時(shí)能以休眠狀態(tài)存在于人類宿主細(xì)胞中，如果將LTR-targeting CRISPR/Cas9復(fù)合物導(dǎo)入HIV病毒或者已經(jīng)誘導(dǎo)的T細(xì)胞中，可以使HIV失去致病性。更重要的是，該復(fù)合物甚至能夠剪切己經(jīng)插入宿主染色體上的病毒基因。三三、應(yīng)用、應(yīng)用與前景與前景三三、應(yīng)用、應(yīng)用與前景與前景CRISPR/Cas9作為第三代人工核酸酶成為目前研究的熱點(diǎn)，相對(duì)于ZFN和TALEN有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：a構(gòu)建簡(jiǎn)單方便快捷，適用于任何分子生物實(shí)驗(yàn)室；b用于基因組的點(diǎn)突變編輯優(yōu)于ZFN或TALEN；cCRISPR/Cas9精確的切口酶活性用于基因治療安全性高于ZFN或TZLEN。 CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種新型的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，它的出現(xiàn)大大推動(dòng)了對(duì)基因功能的研究。但作為一種新興的技術(shù)，它的基礎(chǔ)理論研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，很多分子機(jī)制尚不明確，技術(shù)也不夠成熟。盡管現(xiàn)在