乳兔雪旺細(xì)胞對成兔視神經(jīng)挫傷修復(fù)的作用

1、乳兔雪旺細(xì)胞對成兔視神經(jīng)挫傷修復(fù)的作用【摘要】目的研究乳兔雪旺細(xì)胞(Schwann cell,SC)對成兔視神經(jīng)挫傷修復(fù)的作用。方法建立成兔視神經(jīng)挫傷模型，傷后24 h分別向傷眼玻璃體腔內(nèi)注入SC懸液(A組)、生理鹽水(B組)各01 ml。傷后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC)、軸突染色記數(shù)及閃光視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potentials,FVEP)檢測。結(jié)果傷后4周A、B組RGC平均記數(shù)分別為(19.893.79) /mm和(12.674.12) /mm，軸突密度分別為(94569793) /mm2和(360852

2、85) /mm2，A組明顯高于B組(P0.01)。傷后3dA組傷眼與健眼FVEP幅值比由48%上升至88%，8周時(shí)仍為78%，各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于B組(P0.01)。結(jié)論乳兔SC能夠提高成兔視神經(jīng)挫傷后RGC存活率，減輕軸突變性，顯著促進(jìn)視神經(jīng)功能恢復(fù)，對視神經(jīng)挫傷修復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用?！娟P(guān)鍵詞】視神經(jīng)/病理學(xué)；眼損傷；雪旺氏細(xì)胞；神經(jīng)元；疾病模型，動(dòng)物中分類號(hào)：R77912R338-332文獻(xiàn)編碼：A文章編號(hào)：1005-1015(2000)02-0091-03 Effects of neonatol rabbit Schwann cells on promoting repair of op

3、tic nerve contusion in adult rabbitsCAI Li,HUI Yannian,MA Jixian,et al（Department of Ophthalmology,Xijing Hospital,the 4th Militay Medical University,Xian 710032,China）【Abstract】ObjectiveTo study the effects of neonatol rabbit Schwann cells(SC) on repair of optic contusion in adult rabbitsMethods24h

4、 after the adult rabbit optic nerves was contused,0.1 ml of SC suspension(group A)and saline water(group B)were injected into the vitreous of injured eyes respectively.All the animals were studied by retinal ganglion cell(RGC) and axon counting,flash visual evoked potential(FVEP)tests at various int

5、ervals after injury.ResultsAt the 4th week after injury,the number of RGC was(19.893.79)/mm in group A and (12.674.12)/mm in group B,and the density of axons was(94569793)/mm2 in group A and (36085285)/mm2 in group B.There was dramatical difference between group A and B(P0.01).The amplitude of FVEP

6、wave of group A increased from 48% to 88% on the 3rd day after injury,and still dept 78% at the 8th week and group A was significantly higher than group Bat various intervals(P0.01).ConclusionSC are effective in promoting the repair of optic nerve contusion by increasing the survival rate of RGC,res

7、cuing axons from degeneration,and dramatically promoting the function of the optic nerve.【Key words】Optic nerve/pathology；Eye injnries;Schwann cells;Neurons;Disease models,animal成年哺乳動(dòng)物視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的一部分，損傷后常引起不可逆性視力喪失，目前臨床缺乏有效治療措施。促進(jìn)視神經(jīng)損傷后修復(fù)再生是臨床和基礎(chǔ)研究共同關(guān)注的熱點(diǎn)，視神經(jīng)損傷后體內(nèi)或體外應(yīng)用各類神

8、經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors,NFs)改善神經(jīng)再生微環(huán)境已有報(bào)道1，但關(guān)于雪旺細(xì)胞(SC)對神經(jīng)損傷后修復(fù)過程的影響未見有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察了成兔眼內(nèi)注入乳兔SC對視神經(jīng)挫傷修復(fù)的作用。1材料和方法11乳兔SC培養(yǎng)用文獻(xiàn)2的方法得到90%純度的單層SC后，0.125%的胰酶消化制成SC懸液，改良依格培養(yǎng)液漂洗并離心，調(diào)整細(xì)胞密度至3106個(gè)/ml，立即使用。12成兔視神經(jīng)挫傷模型的建立健康雜色家兔25只，846合劑(解放軍獸醫(yī)研究所研制，01ml/kg)麻醉后固定于兔板上，選左眼為致傷眼，右眼作為正常對照眼。05%的卡因表面麻醉，用自制致傷頭沿眶緣內(nèi)側(cè)向眶尖部深入約172

9、0 cm，觸及視神經(jīng)孔，穩(wěn)定致傷頭與兔頭部后，將重80 g的鋼球從與致傷頭平行接觸，長1 m，與水平線成45夾角的玻璃管內(nèi)落向致傷頭，致傷能量0.55 J。于傷后4h測兔雙眼閃光視覺誘發(fā)電位(FVEP)，傷眼與健眼FVEP幅值比下降至40%60%時(shí)納入實(shí)驗(yàn)，共有20只兔符合條件納入本實(shí)驗(yàn)。13動(dòng)物分組與處理按傷后治療方法不同將20只兔隨機(jī)分為A、B組，每組10只兔。A、B組分別隨機(jī)確定6只兔眼做病理檢查，4只兔眼進(jìn)行視覺電生理檢測。A組傷后24 h，05%的卡因麻醉傷眼，行前房穿刺抽取前房液01 ml后，間接檢眼鏡下自顳上方角膜緣后2 mm,向玻璃體腔中后部視網(wǎng)膜前方注入SC懸液01 ml，共

10、3105個(gè)細(xì)胞；B組同樣方法注入生理鹽水0.1 ml。14檢查方法141視網(wǎng)膜RGC記數(shù)及SC鑒定A、B組分別于傷后3d、1、2、3、4、8周處死1只兔做病理檢查。摘除眼球后去除眼前節(jié)，保留后玻璃體膜，將視網(wǎng)膜固定于眼球固定液中，4h后由視盤邊緣開始向顳側(cè)切分為、3區(qū)，各區(qū)長約15 cm，寬約05 cm。石蠟包埋后各區(qū)均由靠近視盤一側(cè)開始連續(xù)切片，各取前4張切片；其中3張作常規(guī)尼氏染色，在高倍鏡(物鏡40倍)下選取RGC層細(xì)胞最密集的區(qū)域行RGC記數(shù)，每片連續(xù)數(shù)2個(gè)視野；1張作抗S-100抗體(Sigma)的常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。142視神經(jīng)Glee染色記數(shù)A、B組傷后第4、8周處死動(dòng)物后取球

11、后視神經(jīng)5 mm，石蠟包埋后作縱行及橫行切片，常規(guī)Glee染色，光鏡下觀察并照相；A、B組4、8周的Glee染色橫切片各4張采用真彩色醫(yī)學(xué)像分析儀(北京空軍醫(yī)院)定量檢測軸突數(shù)目。143FVEP檢測A、B組各4只兔分別于傷后4h、3 d、1、2、3、4、8周時(shí)進(jìn)行FVEP檢測。用國產(chǎn)VETS-視覺電生理檢查系統(tǒng)，采用全視野連續(xù)白光刺激，頻率2 Hz，光強(qiáng)5檔，記錄儀通頻帶為0.1850 Hz，迭加次數(shù)100次，放大倍數(shù)10。觀測指標(biāo)為FVEP P1波的波幅。15統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Microsoft-Excel計(jì)算軟件處理，分別計(jì)算A、B組傷眼不同時(shí)間點(diǎn)的RGC記數(shù)(/mm)、軸突密度(/mm2)、

12、FVEP幅值比(傷眼/健眼)的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，健眼作為正常對照，行兩組資料的t檢驗(yàn)或2檢驗(yàn)。2結(jié)果21RGC記數(shù)正常對照兔眼視網(wǎng)膜、3區(qū)的RGC平均記數(shù)為(42.077.32) /mm，傷后3d、1、2周時(shí)A、B組間傷眼RGC平均記數(shù)比較差異無顯著性意義(P0.05)。3、4周時(shí)A組RGC下降速度較B組緩慢，RGC數(shù)目明顯高于B組(P0.05)。此后A、B組傷眼RGC數(shù)目趨于穩(wěn)定，8周時(shí)A、B組之間RGC數(shù)目差異仍有顯著性意義(t=3.31,P0.01)(表1)。22SC鑒定A組傷后3d4周時(shí)均可發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜前有抗S-100染色陽性的SC，細(xì)胞散在或聚集分布，細(xì)胞核及胞漿均可著色。也可見少

13、量抗S-100染色陰性，核襯染為藍(lán)色的成纖維細(xì)胞(1，2)。4周后仍可見到SC，但數(shù)目較此前減少。B組3d4周時(shí)視網(wǎng)膜前未見有細(xì)胞成分。23軸突Glee 染色及像分析正常對照視神經(jīng)Glee染色，可見縱切面上軸突排列緊密整齊，膠質(zhì)細(xì)胞散在；橫切面上軸突呈點(diǎn)狀排列，分布均勻，密度約為(124433664)/mm2。傷后4周視神經(jīng)縱切面顯示A組軸突排列較為整齊，沒有明顯的扭曲變形；B組軸突分布極為稀疏，部分扭曲變形，呈串珠樣改變(3，4)。傷后4周A、B組視神經(jīng)橫切面上軸突密度分別為(94569793)/mm2、(36085285) /mm2，傷后8周A、B組視神經(jīng)橫切面上軸突密度分別為(88439

14、684)/ mm2、(53755337) /mm2，A組明顯高于B組(P0.01)。24FVEP檢測傷后4hA、B組傷眼與健眼FVEP幅值比分別為48%、54%，A、B組間差異無顯著性意義(2=0.72,P0.05)。3d時(shí)A組傷眼與健眼FVEP幅值比上升至88%，B組下降至47%，A、B組之間差異有顯著性意義(2=38.31,P0.01)。18周A、B組傷眼與健眼FVEP幅值比均無明顯變化，4周時(shí)A、B組分別為87%、56%，8周時(shí)分別為78%、45%，A組各時(shí)間點(diǎn)幅值均明顯高于B組(P0.01)。3討論傳統(tǒng)理論認(rèn)為視神經(jīng)損傷后RGC突起受損，神經(jīng)元胞體出現(xiàn)逆行性退變、壞死。但近年來的國內(nèi)外

15、研究表明，視神經(jīng)橫斷后90%的RGC在損傷后1周時(shí)表1視神經(jīng)挫傷后不同時(shí)間A、B組傷眼RGC數(shù)目(s)(/mm)Tab.1RGC counts in group A and B at different time after injury(s)(/mm)Groups3 days1 week2 weeks3 weeks4 weeks8 weeksA38.226.4936.674.5728.334.6424.444.5719.893.7919.674.10B39.677.2237.334.2726.444.0719.563.8412.674.1213.443.98t value0.320.450.

16、912.463.883.31Pvalue0.050.050.050.050.010.011A組玻璃體腔內(nèi)注入SC懸液后1周光鏡像。視網(wǎng)膜前可見大量細(xì)胞存在HE100Fig.1Light microscopic photograph of group A at the 1st week after injecting SC into the vitreous.Showing lots of cells before the retinaHE1002A組玻璃體腔注入SC懸液后1周抗S-100染色光鏡像。視網(wǎng)膜前可見大量抗S-100染色陽性的SC(箭)S-100染色100Fig.2S-100 imm

17、unohistochemistry staining of group A at the 1st week after injecting SC into the vitreous.Showing many S-100 positive SC（arrow） before the retinaS-100 staining4003A組視神經(jīng)挫傷后4周視神經(jīng)縱切面光鏡像。神經(jīng)纖維分布排列整齊，無明顯變性Glee400Fig.3Longitude section of optic nerve of group A at the 4th week after the optic nerve was in

18、jured.The neurite lining very sparsely and showing no degenerationGlee staining4004B組視神經(jīng)挫傷后4周視神經(jīng)縱切面光鏡像。神經(jīng)纖維分布極為稀疏，呈串珠樣扭曲變性(箭)Glee400Fig.4Longitude section of optic nerve of group B at the 4th week after the optic nerve was injured.The neurite lining very sparsely and showing severely catenuliform de

19、generation(arrow)Glee staining400表現(xiàn)出典型的凋亡特征，而非壞死特征3。其機(jī)制可能是由于視神經(jīng)損傷后軸漿流運(yùn)輸阻滯，RGC失去靶細(xì)胞分泌的下行性NFs調(diào)節(jié)，使某些原癌基因表達(dá)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。體外實(shí)驗(yàn)已證明減少NFs會(huì)導(dǎo)致半數(shù)以上的神經(jīng)元發(fā)生凋亡。由于SC能夠合成多種NFs，因此能夠避免凋亡程序的啟動(dòng)，提高RGC存活率4，5。本實(shí)驗(yàn)中將活化的乳兔SC植入成兔玻璃體腔內(nèi)1周，A組視網(wǎng)膜前可看到大量抗S-100染色陽性的SC，一直持續(xù)到傷后4周，說明SC移植入眼內(nèi)能夠長期存活6。A組傷后24周RGC下降速度較B組緩慢，4、8周時(shí)RGC平均記數(shù)、軸突密度均顯

20、著高于B組，說明視神經(jīng)挫傷后應(yīng)用SC，能夠有效延緩RGC退變速度，提高RGC存活率，從而阻止軸突繼續(xù)變性。本實(shí)驗(yàn)中A組眼內(nèi)注入SC后僅3d，傷眼/健眼FVEP幅值比就由傷后的48%上升至88%，14周傷眼/健眼FVEP幅值比已接近正常，并顯著高于B組(P0.01)，說明眼內(nèi)注入乳兔SC明顯促進(jìn)了挫傷視神經(jīng)功能的早期恢復(fù)。據(jù)此，我們認(rèn)為視神經(jīng)鈍挫傷不同于視神經(jīng)橫斷傷，挫傷后大量的神經(jīng)纖維并未離斷，臨床所見視神經(jīng)電傳導(dǎo)障礙是由于超微結(jié)構(gòu)的某些改變，如髓鞘結(jié)構(gòu)疏松、板層分離、軸漿流運(yùn)輸阻滯等所導(dǎo)致的。由于視神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)所需要的結(jié)構(gòu)和功能物質(zhì)，均由胞體合成并通過軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)供給，因此RGC細(xì)胞功能狀

21、態(tài)直接決定了神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)是否能夠恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中視神經(jīng)功能迅速恢復(fù)的原因可能為：玻璃體腔內(nèi)植入乳兔SC持續(xù)提供大量外源性的NFs，使損傷的RGC避免發(fā)生凋亡，恢復(fù)正常細(xì)胞功能7，及時(shí)合成大量軸突修復(fù)所需的結(jié)構(gòu)和功能物質(zhì)供給神經(jīng)，挫傷視神經(jīng)修復(fù)因而得以順利進(jìn)行。但其確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。挫傷視神經(jīng)可部分恢復(fù)功能提示促進(jìn)RGC損傷后的自我修復(fù)而非再生，可能是未來治療視神經(jīng)挫傷的重要途徑之一。(本文編輯：唐健)基金項(xiàng)目：全軍九五醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助項(xiàng)目作者單位：蔡莉（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院眼科）惠延年（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院眼科）馬吉獻(xiàn)（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院眼科）郭守一（第四軍醫(yī)大學(xué)空醫(yī)系）參考文獻(xiàn)1，Takano M.Axonal regeneration of retinal ganglion cellsJ.Nippon Ganka Gakkai Zasshi,1996,100:972-980.2，蔡莉，惠延年，孟晉宏兔Schwann細(xì)胞對視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起生長的作用J中華眼底病雜志，1998，14：212-2143，Berkelaar M,Clarke DB,Wan