生物芯片技術(shù)在性病學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

1、KKME-專(zhuān)業(yè)醫(yī)學(xué)搜索引擎生物芯片技術(shù)在性病學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展 分類(lèi) 皮膚性病學(xué) 研究進(jìn)展 【性傳播疾病新進(jìn)展/傅志宜主編-北京：人民軍醫(yī)出版社，20099】描述為： 生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期以來(lái)快速發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)高新技術(shù)，是各學(xué)科交叉綜合的嶄新科學(xué)。生物芯片技術(shù)目前在國(guó)內(nèi)外都取得了較大的進(jìn)展，近年來(lái)該技術(shù)在檢測(cè)性傳播疾病病原體、病原體耐藥性突變及性傳播疾病的診斷中都得到了廣泛應(yīng)用。 為了使臨床醫(yī)師熟悉生物芯片的概念及其在性病學(xué)中的應(yīng)用，本文綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在本領(lǐng)域中的相關(guān)研究進(jìn)展。 生物芯片的概念 生物芯片技術(shù)是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技

2、術(shù)，不僅對(duì)基因功能具有重大的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，而且也具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。生物芯片是指包被在硅片、尼龍膜等固相支持物上的高密度的組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸、糖類(lèi)以及其他生物組分的微點(diǎn)陣。芯片與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的分析?；蛐酒夹g(shù)主要包括芯片微陣列制備、樣品制備、雜交、信號(hào)的檢測(cè)和分析等。蛋白質(zhì)芯片主要是蛋白質(zhì)如抗原或抗體在載體上的有序排列，依據(jù)蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)與核酸相互作用的原理進(jìn)行雜交、檢測(cè)和分析。從不同的組織內(nèi)進(jìn)行活體解剖后取出圓拄狀的組織，然后包埋在受體區(qū)組內(nèi)，這樣的石蠟塊集成體便構(gòu)成了組織芯片。縮微芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip)：在固體材質(zhì)上

3、制造出微型管道網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，從而對(duì)生化樣品進(jìn)行處理和分析，也稱(chēng)為微型全分析系統(tǒng)。液態(tài)芯片又稱(chēng)懸浮陣列流式熒光技術(shù)，是基于美國(guó)公司研制的多功能流式點(diǎn)陣儀(100)開(kāi)發(fā)的多功能生物芯片平臺(tái)，它有機(jī)地整合了編碼微球激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，具有很強(qiáng)的檢測(cè)特異性和靈敏性，可廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體和配體識(shí)別分析等研究，也是目前惟一得到權(quán)威機(jī)構(gòu)和醫(yī)學(xué)界共同認(rèn)可用于臨床診斷的生物芯片平臺(tái)，它具有重復(fù)性好、信噪比高、沒(méi)有灰區(qū)以及高通量的優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本中的多種不同目的分子進(jìn)行分析，可以在3560min內(nèi)對(duì)96個(gè)不同樣本進(jìn)行檢測(cè)。 基因芯片在病原體研

4、究中的應(yīng)用 1人免疫缺陷病毒(HIV)Wout等利用DNA芯片對(duì)HIV-1感染不同時(shí)間后CD4+T淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染后一些基因的表達(dá)受到抑制，且在24h時(shí)最為明顯。其中包括與細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)錄、翻譯和剪接有關(guān)的基因。然而整個(gè)細(xì)胞的活性和信號(hào)傳遞卻增強(qiáng)了，這與有大量的病毒產(chǎn)生一致。Pastinen等設(shè)計(jì)寡核苷酸芯片調(diào)查300多例HIV感染的芬蘭人，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照，發(fā)現(xiàn)只在對(duì)照者中存在趨化因子受體(CCR5)變異的等位基因，而在HIV患者中甘露糖結(jié)合植物血凝素(MBL)變異的等位基因發(fā)生率特別高，進(jìn)一步證實(shí)MBL變異的等位基因在HIV-1傳播中的危害性。黎志東等建立新的HIV亞型

5、分析方法，并檢測(cè)其特異性及敏感性。HIV-111個(gè)亞型及HIV-2的env基因C2V3區(qū)一段核苷酸序列，點(diǎn)樣于經(jīng)預(yù)處理的玻片上，制備成HIV亞型分析基因芯片，并用其對(duì)15份HIV陽(yáng)性樣本進(jìn)行亞型分析，所得結(jié)果與目前常用HIV亞型分析方法即基因序列分析法所得結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果完全符合，敏感性高、特異性好，并且具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、價(jià)廉等特點(diǎn)，有望推廣應(yīng)用。溫穎等以HIV2個(gè)基因型(包括9個(gè)亞型)的32株典型性代表株和HIV-2特有的vpx序列的保守序列為靶序列，設(shè)計(jì)長(zhǎng)寡核苷酸探針，并制備成Oligo芯片。樣品經(jīng)隨機(jī)特異性引物PCR標(biāo)記后與芯片雜交，PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果：1例HIV患

6、者芯片雜交結(jié)果陽(yáng)性，20名健康對(duì)照者血清均為陰性。陽(yáng)性標(biāo)本的序列分析表明，芯片雜交結(jié)果符合測(cè)序的分型結(jié)果。結(jié)論：此芯片可初步用于檢測(cè)血清HIVRNA，并對(duì)HIV基因(亞)型進(jìn)行分析。石向東采用HIV基因芯片對(duì)9例HIV抗體陽(yáng)性母親所生嬰幼兒進(jìn)行檢測(cè)，其中陽(yáng)性2例，陰性7例，與抗體確認(rèn)結(jié)果相比，敏感性和特異性均為100。該方法能夠在嬰幼兒出生48h即可進(jìn)行診斷，判斷HIV垂直傳播的方式，便于干預(yù)和治療。 現(xiàn)在對(duì)于HIV檢測(cè)技術(shù)的原理主要是基于蛋白質(zhì)(抗原或抗體)之間的相互作用。微流控芯片(microfluidicchips)技術(shù)具有制備簡(jiǎn)單、試劑用量少、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，因此在生化分析中的應(yīng)用越來(lái)

7、越受到重視。蔣興宇等采用靜電紡絲技術(shù)(electrospinning，ES)制備納米纖維薄膜，應(yīng)用于微流控芯片檢測(cè)HIV。與商業(yè)薄膜相比，靜電紡絲納米纖維薄膜具有更大的比表面積，對(duì)于被檢測(cè)物的吸附提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，從而使得檢測(cè)的靈敏性有很大提高，在1h內(nèi)就能完成檢測(cè)工作，使用的試劑為常規(guī)用量的幾十分之一。這種結(jié)合微流控技術(shù)和靜電紡絲的新芯片系統(tǒng)(ES-microfluidicchip)具有廉價(jià)、操作方便、便攜、靈敏性高的特點(diǎn)，將推動(dòng)重大流行疾病早期診斷的研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。 2單純皰疹病毒(HSV)HSV感染誘發(fā)一種抗病毒反應(yīng)，此反應(yīng)主要與可溶性干擾素(IFN)的合成和分泌相關(guān)。Mossman等使

8、用表達(dá)19000個(gè)人基因序列的芯片技術(shù)分析了HSV-1感染人肺胚胎細(xì)胞誘發(fā)的IFN非依賴(lài)性抗病毒狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有限的宿主基因被誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因大多數(shù)也可由IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生。他們的數(shù)據(jù)指出一種新的不依賴(lài)IFN的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制的存在來(lái)檢測(cè)病毒的感染。通過(guò)HSV誘導(dǎo)和解除系統(tǒng)來(lái)解釋這種機(jī)制，將增加我們對(duì)病毒一宿主相互作用的基礎(chǔ)生物學(xué)的理解，幫助我們合理的設(shè)計(jì)用于基因治療的病毒載體。Sting-ley等用DNA芯片技術(shù)成功地分析HSV-1轉(zhuǎn)錄的整個(gè)過(guò)程。有效地檢測(cè)了所有病毒轉(zhuǎn)錄水平且在感染的不同條件下定量病毒的含量。同時(shí)利用該技術(shù)分析了-27(UL54)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在感染突變病毒株細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，約在感染后

9、6h其表達(dá)水平分3種情況：一種情況為-27基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)水平上調(diào)或不變；其次為表達(dá)水平稍下降；最后一種情況為明顯下降。-27基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平上調(diào)，提示其主要在病毒感染的早期起調(diào)節(jié)作用。 3沙眼衣原體(CT)和解脲脲原體(Uu)Ren等利用DNA芯片對(duì)CT感染后宿主細(xì)胞THP-1基因表達(dá)譜的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與未感染的細(xì)胞比較，感染后細(xì)胞中有548個(gè)基因上調(diào)或下調(diào)表達(dá)至少2倍。這些基因包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和信號(hào)分子等，從而進(jìn)一步顯示出CT感染后宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可能影響每個(gè)生物體的感染周期。Dessus-Babus等設(shè)法研究衣原體感染上皮細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)，這些信號(hào)能觸發(fā)自然反

10、應(yīng)和調(diào)節(jié)多形核中性粒細(xì)胞趨化現(xiàn)象；使用cDNA微陣列技術(shù)檢測(cè)了CT血清型E和L2感染的極化宮頸內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子；結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清型E或L2感染的Hela細(xì)胞誘發(fā)一種強(qiáng)烈反應(yīng)并類(lèi)似多形核中性粒細(xì)胞的化學(xué)趨化現(xiàn)象，感染血清型L2的細(xì)胞產(chǎn)生大量的白介素(IL-8)和(IL-11)，感染兩型均產(chǎn)生中等量的IL-6，但在兩型感染細(xì)胞培養(yǎng)的懸浮物中均未檢測(cè)到IL-1和腫瘤壞死因子(TNF-)；IL-11并不影響CT感染的多形核中性粒細(xì)胞反應(yīng)，大量分泌這種抗炎細(xì)胞因子主要作用于巨噬細(xì)胞，在感染的早期可能使CT逃避自然防御而產(chǎn)生感染。Nicholson等利用DNA芯片比較發(fā)展周期中不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)譜分析

11、CT不同發(fā)展時(shí)期特異性地轉(zhuǎn)錄。時(shí)間點(diǎn)選為6、12、18、24、36h，代表的時(shí)間與表型的改變有關(guān)。微陣列分析檢測(cè)RNA在相關(guān)不同器官中出現(xiàn)，存在一個(gè)固有的相關(guān)基因表達(dá)體系，然而基因的表達(dá)量有3倍的改變就是不正常的。他們通過(guò)芯片技術(shù)在CT生長(zhǎng)周期中5個(gè)重要的時(shí)間點(diǎn)描述CT的轉(zhuǎn)錄，為基因的改變提供了一個(gè)全面的基因組范圍內(nèi)的描述。李玉葉等為評(píng)價(jià)基因芯片在檢測(cè)淋球菌(NG)、CT和Uu中的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)697例NG檢測(cè)樣本、663例CT檢測(cè)樣本及653例Uu檢測(cè)樣本均用現(xiàn)有臨床常規(guī)檢測(cè)(培養(yǎng)法檢測(cè)NG及Uu，免疫層析法檢測(cè)CT)、PCR檢測(cè)及基因芯片檢測(cè)。以臨床常規(guī)檢測(cè)為參照，分析基因芯片檢測(cè)與臨床常規(guī)

12、檢測(cè)結(jié)果的符合情況；以臨床常規(guī)檢測(cè)和PCR檢測(cè)為參照，分析基因芯片檢測(cè)的敏感性及特異性。結(jié)果：基因芯片檢測(cè)結(jié)果與臨床常規(guī)方法的符合率為：NG陽(yáng)性符合率為992，陰性符合率為979；CT陽(yáng)性符合率為1000，陰性符合率為972；Uu陽(yáng)性符合率為845，陰性符合率為971?；蛐酒瑱z測(cè)NG的敏感性為991，特異性為993；基因芯片檢測(cè)CT的敏感性為989，特異性為995；基因芯片檢測(cè)Uu的敏感性為985，特異性為995。結(jié)論：基因芯片檢測(cè)泌尿生殖道NG、Uu及CT的特異性和敏感性均較高，在泌尿生殖道病原學(xué)診斷中有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。 4人乳頭瘤病毒(HPV)HPV感染角化細(xì)胞引起增生性損壞。在被感

13、染的細(xì)胞中，病毒基因的產(chǎn)物改變了細(xì)胞內(nèi)蛋白的活性，如Rb和p53，從而改變了細(xì)胞生長(zhǎng)周期?？赡蹾PV基因產(chǎn)物也改變了細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。Chang等利用芯片技術(shù)檢測(cè)高危險(xiǎn)度的HPV31所有基因在表達(dá)上的改變。在7075個(gè)已知基因和表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetags，ES-Ts)測(cè)試中，發(fā)現(xiàn)HPV31感染細(xì)胞與正常的角化細(xì)胞比較時(shí)178個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，150個(gè)基因表達(dá)下調(diào)了2倍或更多。雖然沒(méi)有特殊的模型可以說(shuō)明這些上調(diào)和下調(diào)的基因，但這些基因大致可以分為3類(lèi)：調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的，在角化細(xì)胞中特別表達(dá)的和在IFN刺激下表達(dá)增強(qiáng)的基因。而后他們又對(duì)HPV的基因產(chǎn)物改變細(xì)胞對(duì)IFN的反

14、應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)HPV的基因產(chǎn)物通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄子(Star-1)的活性來(lái)抑制IFN帶來(lái)的反應(yīng)從而逃避免疫監(jiān)視。Klaassen等開(kāi)發(fā)了一種新型高密度寡核苷酸芯片對(duì)HPV進(jìn)行檢測(cè)和分型，能夠?qū)δ壳?3種黏膜型HPV進(jìn)行檢測(cè)和鑒別。其中的45種類(lèi)型可以通過(guò)1條單一的種類(lèi)特異性探針進(jìn)行鑒別，相反還有8種黏膜型HPV需要通過(guò)與探針的特異性結(jié)合來(lái)鑒別。這種簡(jiǎn)單的分析模式不需昂貴的儀器，在配有PCR儀的診斷實(shí)驗(yàn)室里就可以進(jìn)行。為探討宮頸癌、癌前病變、尖銳濕疣與HPV感染的關(guān)系，為早期防治宮頸癌提供臨床依據(jù)，周劍波等在381例患者中采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)病變標(biāo)本HPV-DNA進(jìn)行檢測(cè)，用上述方

15、法無(wú)法明確HPV型別的標(biāo)本，采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)。結(jié)果子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN) 、CIN 和宮頸鱗癌的標(biāo)本中HPV的檢測(cè)率均為100，以HPV16型感染為主，但存在2種以上HPV型別感染，在子宮內(nèi)膜癌中主要是HPV18，仍然存在HPV多種型別混合感染。196例女陰尖銳濕疣中，HPV陽(yáng)性率為964，其中以HPV6(444)和HPV11(286)為主，少數(shù)患者是HPV16和(或)HPV18感染，也有少數(shù)為2種以上甚至四重HPV感染。結(jié)論：子宮及宮頸瘤變主要以高危型HPV16和HPV18為主，外陰生殖道的尖銳濕疣以低危型HPV6和HPV11為主，但兩者都可合并多種型別的HPV混合感染，給臨床治療和

16、患者機(jī)體病理生理改變?cè)斐梢欢ǖ膹?fù)雜性。為了解尖銳濕疣組織中感染HPV的亞型分布，治療后原皮損部位的攜帶情況及性病門(mén)診隱性感染的發(fā)生率，黃進(jìn)波利用基因芯片對(duì)1625例性病門(mén)診就診者進(jìn)行23種亞型檢測(cè)。結(jié)果693例患者皮損組織陽(yáng)性率為9365，共檢出21種亞型，其中低危型HPV6、11和43出現(xiàn)頻率分別為5115、3667和693，高危型HPV16、33、18、31、73、58和59出現(xiàn)的頻率分別為1479、647、600、493、477、462和385，單一感染占6749，重疊感染占3251；189例患者治療后半年內(nèi)原皮損部位的攜帶率為5026，HPV58出現(xiàn)頻率最高(2421)；743例非患者

17、隱性感染率為1884，共檢出17種亞型，低危型以HPV6、11和43為主，出現(xiàn)頻率分別為2429，200和786，高危型以HPV16、18、58、35、33、56和59亞型為主，出現(xiàn)頻率分別為1786、1000、1000、714、571、571和571，單一感染占7714，重疊感染占2286。作者認(rèn)為HPV11、6、16型感染是尖銳濕疣的主要型別，HPV58可能是最難治療的病毒亞型，隱性感染在性病門(mén)診就診者中較常見(jiàn)。Mendoza-LorenzoP應(yīng)用一種寡核苷酸芯片檢測(cè)HPV16有5種突變體。 基因芯片在檢測(cè)病原體耐藥性突變中的應(yīng)用 Lipshutz等用基因芯片技術(shù)篩選HIV-1病毒反轉(zhuǎn)錄酶

18、和蛋白酶的突變基因，這種基因突變能使HIV-1病毒對(duì)齊多夫定(AZT)等抗病毒藥產(chǎn)生耐藥。1996年，Kozal等在臨床上利用芯片技術(shù)研究病毒抗藥基因，對(duì)102例患者167例分離病毒的基因多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)美國(guó)HIV-1包膜B蛋白酶極其多變，99個(gè)氨基酸中475存在變異，而且在從未用蛋白酶抑制劑治療的患者分離到的HIV-1毒株中也觀(guān)察到包膜氨基酸的自然多態(tài)性，其中許多氨基酸改變與抗蛋白酶抑制劑的抗藥性有關(guān)。HIV-1蛋白主要變異在于包膜蛋白，這種自然突變對(duì)臨床治療與預(yù)后具有重要意義。目前，Affymetrix公司開(kāi)發(fā)出一種檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄酶基因(rev)的HIV芯片，用于rev各種突變型的檢測(cè)，因

19、此，人們可以像腫瘤藥敏試驗(yàn)一樣，預(yù)測(cè)艾滋病患者對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(如AZT等)的抗性，指導(dǎo)艾滋病的藥物治療。 蛋白芯片在性傳播疾病診斷中的應(yīng)用 Bacarese-Hamilton等曾將蛋白芯片用于病毒感染性疾病的血清學(xué)檢測(cè)。用點(diǎn)樣儀將微生物抗原點(diǎn)樣，直接測(cè)定血清鼠弓形蟲(chóng)、風(fēng)疹病毒、 型和 型單純皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒的抗體，并用ELISA法作為對(duì)照，結(jié)果顯示蛋白芯片法和ELISA法檢測(cè)的符合率達(dá)80以上。因此，蛋白芯片技術(shù)能夠用于臨床診斷，且與ELISA法相比具有高通量、低價(jià)格、更便利等優(yōu)點(diǎn)。西安聯(lián)爾生物技術(shù)有限公司研制的性傳播疾病蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)可檢測(cè)HPV6、11，Uu，CT和NG。 應(yīng)用專(zhuān)利

20、情況 1吳海，肖學(xué)葵，孫曉豐，陳秋雯。一種對(duì)丙型肝炎、乙型肝炎、艾滋病和梅毒病毒進(jìn)行共檢的基因芯片及其檢測(cè)方法(CN1405322)。 2王磊，劉丹，許天正，王金忠。檢測(cè)HIV對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抗性的基因芯片及試劑盒(CN1982473)。 3馮鐵建，趙廣錄，王曉輝，陳琳，石向東。HIV基因檢測(cè)芯片，其制備方法和應(yīng)用其檢測(cè)HIV核酸的方法(CN101045946)。 4周文明，趙建龍，張學(xué)軍，曹慧敏，楊森，趙輝。泌尿生殖道炎癥病原體和耐藥性集成診斷基因芯片及方法(CN1570145)。 5毛裕民，謝毅，李瑤。用于感染性疾病乙型肝炎病毒、梅毒螺旋體、艾滋病病毒和丙型肝炎病毒診斷的基因芯片(CN1310236)。 展望 性傳播疾病發(fā)病率越來(lái)越高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)身心健康，由于引起性傳播疾病病原體的種類(lèi)繁多，其癥狀及并發(fā)癥各異，并存在混合感染、耐藥等一系列臨床有待解決的問(wèn)題，故對(duì)其早期診斷和預(yù)防已是當(dāng)務(wù)之急。盡管由于近幾年基因診