PCR實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析（課堂PPT）

1、.1.2.3PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng).4PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物.5PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAG

2、CTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶.6PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。 但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了.7PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核

3、酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng).8PCR技術(shù)簡(jiǎn)介-定義 PCR: polymerase chain reaction 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR技術(shù)是一種體外模擬自然技術(shù)是一種體外模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的復(fù)制過(guò)程的核酸

4、擴(kuò)增技術(shù)，亦稱為無(wú)細(xì)胞分子克隆技術(shù)。它核酸擴(kuò)增技術(shù)，亦稱為無(wú)細(xì)胞分子克隆技術(shù)。它是以待擴(kuò)增的兩條是以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，在一對(duì)人工合鏈為模板，在一對(duì)人工合成的寡核苷酸引物的介導(dǎo)下，通過(guò)耐高溫成的寡核苷酸引物的介導(dǎo)下，通過(guò)耐高溫DNA聚聚合酶的酶促作用，快速特異地?cái)U(kuò)增出特定的合酶的酶促作用，快速特異地?cái)U(kuò)增出特定的DNA片斷。片斷。 簡(jiǎn)單的講，簡(jiǎn)單的講， PCR技術(shù)即通過(guò)引物延伸核酸的某技術(shù)即通過(guò)引物延伸核酸的某個(gè)區(qū)域而進(jìn)行的重復(fù)雙向個(gè)區(qū)域而進(jìn)行的重復(fù)雙向DNA合成。合成。.9.10.11 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5端之間，是

5、需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3端開(kāi)始延伸，其5端是固定的，3端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反

6、應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。 .12PCR技術(shù)簡(jiǎn)介PCR反應(yīng)所用酶：反應(yīng)所用酶： 早期的早期的PCR方法采用大腸桿菌方法采用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片斷催化退火的寡核苷酸引物進(jìn)行延伸反片斷催化退火的寡核苷酸引物進(jìn)行延伸反應(yīng)。由于該酶會(huì)在進(jìn)行應(yīng)。由于該酶會(huì)在進(jìn)行DNA變性的溫度下失活，變性的溫度下失活，所以在每一輪合成反應(yīng)中都須重新加所以在每一輪合成反應(yīng)中都須重新加1份酶。并份酶。并且在擴(kuò)增較長(zhǎng)模板是效果不夠理想，產(chǎn)率較低，且在擴(kuò)增較長(zhǎng)模板是效果不夠理想，產(chǎn)率較低，有一些錯(cuò)配，導(dǎo)致產(chǎn)物大小不均一。有一些錯(cuò)配，導(dǎo)致產(chǎn)物大小不均一。 耐熱耐熱DNA

7、聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌嗜熱水聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌嗜熱水生菌種提純出來(lái)的，經(jīng)生菌種提純出來(lái)的，經(jīng)95持續(xù)溫育仍有活性，持續(xù)溫育仍有活性，不會(huì)在加熱變性中失活，故無(wú)需每輪反應(yīng)都重新不會(huì)在加熱變性中失活，故無(wú)需每輪反應(yīng)都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和變性可以在加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和變性可以在更高溫度下進(jìn)行，使引物和模板間的誤配大大減更高溫度下進(jìn)行，使引物和模板間的誤配大大減少，提高了擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率，并且可以少，提高了擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率，并且可以擴(kuò)增更長(zhǎng)的產(chǎn)物。擴(kuò)增更長(zhǎng)的產(chǎn)物。.13()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20.14.151

8、234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍.16.17 PCR中后期，隨著目的DNA擴(kuò)展產(chǎn)物逐漸積累，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的增加減慢，進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即為停滯效應(yīng)，又稱平臺(tái)期。.18操作方法 1 在PCR反應(yīng)管中加入buffer2.5ul 2 向PCR加入dntp0.5ul 3 加入primer 0.5ul 4 加入模板0.5ul 5 加酶0.5ul 6 加水20.5u

9、l，至總體積為25微升？按緊蓋子， 輕輕混勻， 放入PCR儀 如何加樣才能加得準(zhǔn)？.195 反應(yīng)條件 942-5分鐘 94 40sec 57 40sec 72 1min 30sec 72 10min30-35cycle.20電泳緩沖液的配制 50TAE Buffer 配制方法： 1 稱量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L燒杯中； 2 向燒杯中加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?3 加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4。用NaOH調(diào)pH至8.3，加去離子水定容至1L后，室溫保存。 使用時(shí)稀釋50倍 即1TAE Buffer 1.5%.21電泳 按照5份PC

10、R產(chǎn)物與一份6loadingbuffer混合，取10-15ul混合液加入膠中，其中一孔加一份Marker對(duì)照，電泳，電壓120，電泳半個(gè)小時(shí)，放入EB染色液中，染色半個(gè)小時(shí)，。.22PCR技術(shù)簡(jiǎn)介 PCR常見(jiàn)問(wèn)題：常見(jiàn)問(wèn)題：一一.出現(xiàn)假陰性；出現(xiàn)假陰性；二二.出現(xiàn)假陽(yáng)性；出現(xiàn)假陽(yáng)性；三三.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶；出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶；四四.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶。.23PCR技術(shù)簡(jiǎn)介一一.PCR出現(xiàn)假陰性原因：出現(xiàn)假陰性原因： 1模板因素：模板因素： 2酶失活：酶失活： 3引物：引物： 4Mg2+濃度：濃度： 5反應(yīng)體積的改變：反應(yīng)體積的改變： 6物理原因：物理原因： 7靶序列變

11、異：靶序列變異：.24PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 模板因素：模板因素：（1）模板中含有雜蛋白；（2）模板中含有Taq酶抑制劑；（3）模板中蛋白質(zhì)殘留， 特別是染色體中的組蛋 白殘留；（4）提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多；（5）模板核酸變性不徹底。.25PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 模板因素引起假陰性解決方案：模板因素引起假陰性解決方案：1.配制有效而穩(wěn)定的消化處理液;2.提取程序固定,不宜隨意改動(dòng)；3.模板DNA的溶解液應(yīng)固定不變。.26PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 酶失活：酶失活：1.酶本身的質(zhì)量

12、問(wèn)題(供應(yīng)商的問(wèn)題）；2.酶存放時(shí)間太長(zhǎng)；3.酶存放方式不當(dāng)，或其他意外原因；4.忘記添加Taq酶。.27PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 酶失活引起假陰性解決方案：酶失活引起假陰性解決方案：1.檢查加樣程序及過(guò)程，看是否忘記加Taq酶；2.更換新的Taq酶;3.新舊兩種Taq酶同時(shí)使用。.28PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 引物：引物：1.引物質(zhì)量；2.引物濃度；3.兩條引物的濃度是否對(duì)稱等。 .29PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 引物引起假陰性解決方案引物引起假陰性解決方案:1.選定一個(gè)好的引物合

13、成單位選定一個(gè)好的引物合成單位;2.引物濃度不僅要看引物濃度不僅要看OD值，稀釋時(shí)更要平衡其摩爾值，稀釋時(shí)更要平衡其摩爾濃度；濃度；3.引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止反復(fù)凍融或長(zhǎng)引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止反復(fù)凍融或長(zhǎng)期冷凍保存，導(dǎo)致引物的變質(zhì)降解失效，也可要期冷凍保存，導(dǎo)致引物的變質(zhì)降解失效，也可要求合成單位將固體分裝；求合成單位將固體分裝；4.引物設(shè)計(jì)不合理，如長(zhǎng)度不夠，引物本身或兩條引物設(shè)計(jì)不合理，如長(zhǎng)度不夠，引物本身或兩條引物之間形成二聚體等。引物之間形成二聚體等。.30PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 Mg2+濃度：濃度： Mg2+濃度對(duì)濃度對(duì)PCR擴(kuò)

14、增效率影響極大，擴(kuò)增效率影響極大，濃度過(guò)高可降低濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性；擴(kuò)增的特異性；濃度過(guò)低則影響濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗，出現(xiàn)假陰性。擴(kuò)增失敗，出現(xiàn)假陰性。.31PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 Mg2+濃度引起假陰性解決方案：濃度引起假陰性解決方案： 設(shè)置一組反應(yīng)，其中每一反應(yīng)設(shè)置一組反應(yīng)，其中每一反應(yīng)中的其他離子濃度相同（如中的其他離子濃度相同（如Tris.Cl,KCl等），而等），而MgCl2濃度不濃度不同（由同（由0.56mmol/L,每次增加每次增加0.5mmol/L)，由此來(lái)摸索最佳，由此來(lái)摸索最佳M

15、g2+濃度。濃度。.32PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 反應(yīng)體積的改變：反應(yīng)體積的改變： 做小體積做小體積PCR后，再做大體積時(shí)，后，再做大體積時(shí)，一定要重新摸索條件，而非簡(jiǎn)單地將一定要重新摸索條件，而非簡(jiǎn)單地將反應(yīng)體系中的各個(gè)成分加大幾倍，否反應(yīng)體系中的各個(gè)成分加大幾倍，否則易失敗。則易失敗。.33PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 物理原因：物理原因：1.變性溫度低，變性時(shí)間短；變性溫度低，變性時(shí)間短；2.退火溫度過(guò)高，影響引物與模板的結(jié)退火溫度過(guò)高，影響引物與模板的結(jié)合而降低合而降低PCR擴(kuò)增效率；擴(kuò)增效率；3.延伸時(shí)間過(guò)短等。

16、延伸時(shí)間過(guò)短等。.34PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 物理原因引起假陰性解決方案：物理原因引起假陰性解決方案：1.提高變性溫度，延長(zhǎng)變性時(shí)間，特別是首次循環(huán)，必要時(shí)可設(shè)為95 ，10min，或PCR反應(yīng)以前在開(kāi)水中煮沸幾分鐘。2.退火溫度應(yīng)根據(jù)Tm值來(lái)設(shè)定，也可首先將退火溫度設(shè)為45 ，然后再逐次提高（以2 /次為宜）。3.延伸溫度以1000bp/min足夠，必要時(shí)也可適當(dāng)延長(zhǎng)，特別是末次循環(huán)，一定要延伸10min。.35PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 靶序列變異：靶序列變異： 靶序列變異導(dǎo)致假引性的情況常靶序列變異導(dǎo)致假引性的情

17、況常常發(fā)生在靶序列變異正好發(fā)生于特異常發(fā)生在靶序列變異正好發(fā)生于特異性引物與之結(jié)合部的中間，使引物失性引物與之結(jié)合部的中間，使引物失效。效。 解決方案：解決方案： 根據(jù)已知序列重新選擇區(qū)段設(shè)計(jì)引根據(jù)已知序列重新選擇區(qū)段設(shè)計(jì)引物。物。.36PCR技術(shù)簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介二二.PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性原因：出現(xiàn)假陽(yáng)性原因：1.引物設(shè)計(jì)不合適；2.靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。（1）整個(gè)基因組或大片段的污染；（2）空氣中的小片斷核酸污染。 .37PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性原因分析及解決方案 引物設(shè)計(jì)不合適：引物設(shè)計(jì)不合適： 1.選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，從而擴(kuò)增出非目的性序列的PCR產(chǎn)物。2.靶序列太短或引物太短

18、導(dǎo)致特異性不強(qiáng)。 解決方案：解決方案： 選擇特異性強(qiáng)的區(qū)段設(shè)計(jì)引物。選擇特異性強(qiáng)的區(qū)段設(shè)計(jì)引物。.38PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性原因分析及解決方案 整個(gè)基因組或大片段的污染的解決方整個(gè)基因組或大片段的污染的解決方案：案：1.操作時(shí)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管污染環(huán)境。2.除酶及不耐熱物品外，所有試劑及耗材均應(yīng)高溫高壓消毒，所用離心管及槍頭均應(yīng)一次性使用。3.必要時(shí)，加樣本前，反應(yīng)管及試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。.39PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性原因分析及解決方案 空氣中的小片斷核酸污染：空氣中的小片斷核酸污染： 這些小片斷比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)。 解決方案：解決方案： 運(yùn)用巢式PCR來(lái)減輕或消除。.40PCR技術(shù)簡(jiǎn)介三三.出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶原因：出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶原因：1.引物與靶序列不完全互補(bǔ)，或引物聚合形成二聚體；2.Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多；3.酶的質(zhì)量不過(guò)關(guān)，或加Taq酶的量過(guò)多。.41PCR技術(shù)簡(jiǎn)介 PCR出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶解決方案：出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶解決方案：1.必要時(shí)重新設(shè)計(jì)合成引物；必要時(shí)重新設(shè)計(jì)合成引物；2.減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶；減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶；3.