非放射性標(biāo)記物BrdU研究進(jìn)展

1、非放射性標(biāo)記物BrdU研究進(jìn)展 溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine ,BrdU）是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競(jìng)爭摻入S期細(xì)胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU與胸腺嘧啶競(jìng)爭摻入的強(qiáng)度可能與細(xì)胞增殖異常有關(guān)，如肝癌細(xì)胞約11.6%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝細(xì)胞僅有1.1%1。既往在分子遺傳學(xué)等研究中常采用同位素標(biāo)記，但有放射污染，技術(shù)難度大，實(shí)驗(yàn)周期長等缺點(diǎn)。近年來非放射性標(biāo)記物的研究發(fā)展迅速，然而其敏感性多數(shù)不及同位素，使實(shí)驗(yàn)應(yīng)用受限。自82年Gratzer制備出抗BrdU單抗及標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)不斷改良提高，應(yīng)用BrdU標(biāo)記的敏感性已與氘胸腺嘧啶核苷（3H-TdR

2、）相似2，3。目前認(rèn)為BrdU是最有希望取代同位素的非放射性標(biāo)記物之一。本文綜述近年來BrdU研究概況，重點(diǎn)介紹標(biāo)記過程中有關(guān)技術(shù)問題。 一、標(biāo)記技術(shù)：1、劑量和途徑：BrdU可用于體內(nèi)或體外標(biāo)記，體內(nèi)標(biāo)記時(shí)，實(shí)驗(yàn)鼠按體重60mg-200mg/kg于鼠腹膜下注射4，5，狗按體重100mg/kg靜脈注射6，人體以表面積150g/m2用量，取標(biāo)本前8.25-10h靜脈注射7，免疫組化檢測(cè)。BrdU經(jīng)靜脈給藥一般無副作用，偶有報(bào)道過量可致細(xì)胞突變。體外標(biāo)記的研究廣泛而深入，通常將保存在培養(yǎng)液中的新鮮組織剪啐至1-2mm3大小，離心去除了上清液后，加入100g/mlBrdU，或新鮮組織在 0.3mg/

3、ml濃度的BrdU中37攝氏度1小時(shí)，然后固定包埋8，細(xì)胞標(biāo)記在RPMI1640-10培養(yǎng)液中進(jìn)行，細(xì)胞數(shù)低于1106/ml，加入20l的BrdU孵育 209。2、標(biāo)本處理：適當(dāng)?shù)臉?biāo)本處理對(duì)BrdU染色強(qiáng)度至關(guān)重要。Meyer對(duì)450例乳腺癌組織體外標(biāo)記總結(jié)出3點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)：（1）切組織塊1mm厚；（2）固定前組織有代謝活力；（3）封閉脫氧胸腺核苷合成酶2，因此酶能使脫氧尿苷轉(zhuǎn)變成脫氧胸苷，從而阻止內(nèi)源性脫氧胸苷與BrdU競(jìng)爭摻入DNA。Xiang最近回顧大量文獻(xiàn)。廣泛討論固定包埋方法后，制備狗脛骨骨折模型，設(shè)3組對(duì)照研究，結(jié)果證明70%乙醇固定，epon包埋未脫鈣狗骨組織的BrdU染色效果最好6。

4、Swales和Smith用BrdU單抗在超微水平研究昆蟲血腦屏障，重點(diǎn)探討標(biāo)記過程對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征的影響。作者比較4種固定后得出如下結(jié)論：（1）單用多聚甲醛固定可獲得良好的標(biāo)記效果，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)易損傷，可加入單節(jié)顯性戊二醛（minomeric glut-aldehyde）聯(lián)合固定；（2）等滲緩沖液加蔗糖磷酸/鹽酸緩血酸胺緩沖劑或PBS對(duì)保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)有較好效果；（3）用脫氧膽酸處理可增加標(biāo)記，促進(jìn)抗體聯(lián)接，該項(xiàng)研究清晰顯示線粒體，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)果器10。也有人建議如準(zhǔn)備蛋白酶消化時(shí)，可用甲醛固定，而不用Carnoy或乙醇。3、DNA變性BrdU摻入單鏈DNA堿基序列須經(jīng)酸、堿、酶或加熱等打

5、開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，離子鍵和堿基推積力使DNA雙鏈分離單鏈。DNA變性方式及程度直接影響標(biāo)記效果，Williamson等回顧123份關(guān)于結(jié)直腸癌的報(bào)告，發(fā)現(xiàn)用酸變性約占80%，作者在0.05-3.00MHCL間設(shè)9個(gè)濃度比較分析，對(duì)每種濃度作用的組織切片分別數(shù)5103個(gè)細(xì)胞，結(jié)果冰凍切片0.01M hCL濃度變性后標(biāo)記指數(shù)最高。低濃度酸產(chǎn)生高LI的原因可能DNA雙鏈?zhǔn)Х€(wěn)態(tài)，組胺蛋白離解產(chǎn)生易使抗原摻入的SSSNA片段，另有人提出用低濃度酸從DNA離解出組胺蛋白后加熱變性，可避免組胺產(chǎn)生穩(wěn)定DNA低抗熱變性的作用。消除組胺可降低原位DNA的熔解溫度閾，酸預(yù)處理使染色質(zhì)核小體結(jié)構(gòu)幾乎全部破

6、壞，從而使DNA解螺旋更廣泛11。堅(jiān)持熱變性者認(rèn)為加熱較酸對(duì)BrdU摻入能提供更多結(jié)合部位。此外，變性和單抗孵育須嚴(yán)格銜接，如變性后BU20a單抗孵育延誤1小時(shí)，BrdU陽性細(xì)胞核標(biāo)記數(shù)便從6.6%降至1.4%7，說明影響LI的因素復(fù)雜，加單抗前仔細(xì)研究變性技術(shù)及干擾因素，從而獲得BrdU標(biāo)記應(yīng)有的高LI是必要的。另外采作BrdU標(biāo)記核酸分子可能對(duì)DNA變性有特殊要求，需進(jìn)一步探索。4、標(biāo)記染色：如何延長BrdU作用時(shí)間以標(biāo)記新進(jìn)入S期的細(xì)胞。使增殖緩慢的細(xì)胞標(biāo)記率提高，是另一個(gè)重要問題，早年有人用恒定套管裝置和非生物降解彈丸對(duì)大鼠研究，但結(jié)果重復(fù)性差。近來Maysinger研制一種具有很好的

7、生物相容性可降解的微囊用于體內(nèi)、外標(biāo)記，通過電鏡、影像技術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)分析，證明微囊中BrdU能有效摻入鼠腦疾患周圍的增生細(xì)胞核中，可連續(xù)釋放高濃度BrdU達(dá)48-50小時(shí)12。另有人研究滲透性微囊和緩彈丸，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記效果均優(yōu)于單次注射。研究非放射性標(biāo)記物常與放射性標(biāo)記物相比，以證明特異性，敏感性及其它有關(guān)特性，在同一靶細(xì)胞比較似乎更具有說服力。然而3H-T d R和BrdU的比標(biāo)記研究不能在同一時(shí)間給藥，因兩種標(biāo)記物在同一個(gè)細(xì)胞增殖周期內(nèi)競(jìng)爭胸腺嘧啶激酶。有人認(rèn)為兩種標(biāo)記先后給藥均可，另有主張先標(biāo)BrdU，理由是3H-TdR放射自顯影乳膠用胰酶去除時(shí)偶有細(xì)胞丟失，致其后BrdU標(biāo)記信號(hào)損失，

8、Lin等強(qiáng)調(diào)BrdU標(biāo)記時(shí)間較3H-TdR長約50分鐘，如先標(biāo)記3H-TdR可望BrdU能標(biāo)記更多早期S期細(xì)胞3。Thoolen從另外角度觀察兩種標(biāo)記染色之間關(guān)系，將成年的雄鼠分3組，腹膜下分別注射3H-TdR，BrdU和兩中標(biāo)記物曲小時(shí)后取睪丸標(biāo)記處理，免疫金銀法染色，分別計(jì)數(shù)精原細(xì)胞每組平均陽性胞核數(shù)量，結(jié)果3H-TdR標(biāo)記為162個(gè)，BrdU標(biāo)記為166個(gè)，雙標(biāo)記為146個(gè)說明90% BrdU摻入的清原細(xì)胞顯示3HTd R標(biāo)記，另有10%胞核僅顯示一種標(biāo)記，無交叉性。3H-TdR的射線散射范圍有限，使放射自顯影反應(yīng)不可能超過遠(yuǎn)離乳膠1m以上的胞核，這些胞核或許能被BrdU標(biāo)記顯色，少數(shù)細(xì)

9、胞僅接受一種標(biāo)記的確切原因不清楚，也可能與堿基配對(duì)所形成的氫鍵數(shù)量有關(guān)。此外已證明微波，氯化鋰13、氟尿嘧啶核苷等均有助于BrdU標(biāo)記。二、檢測(cè)：BrdU特異摻入S期細(xì)胞，通常測(cè)定其LI，即S期細(xì)胞占細(xì)胞周期的百分?jǐn)?shù)，標(biāo)記陽性為光鏡下致密覆蓋于胞核上的褐色沉淀物。檢測(cè)方法用單抗或多抗的免疫化學(xué)法，也可用DNA熒光染料染色的細(xì)胞化學(xué)法。目前常用免疫金銀法，因該法不受內(nèi)源性過氧化酶影響，較免疫酶標(biāo)法有更好對(duì)照背景。不同類型細(xì)胞DNA對(duì)變性敏感性的差別可能由染色質(zhì)結(jié)構(gòu)決定，某些類型對(duì)變性反應(yīng)遲鈍，使檢測(cè)不敏感或失敗，有人提倡單抗聯(lián)接BrdU后用FCM檢測(cè)較免疫組化法更客觀省時(shí)，且可測(cè)出腫瘤倍體14。

10、但需注意惡性瘤常伴組織及細(xì)胞壞死，BrdU不能摻入死亡細(xì)胞，故用FCM分析須除外死亡細(xì)胞，否則可被錯(cuò)誤當(dāng)成靜止細(xì)胞。胰酶和Dnase混合孵育細(xì)胞標(biāo)本有可能克服死亡細(xì)胞干擾三、BrdU標(biāo)記和3H-T d R標(biāo)記的比較與32P、35S等常用放射性核素相比，3H-TdR釋放的-粒子能量低，散射極少，因此感光乳膠上的成影分辨最高，放射性損傷相對(duì)較小，且半衰期較長。3H-TdR標(biāo)記用放射自顯影術(shù)和閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)，靈敏度高，結(jié)果確切。其應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)肯定。因此研究非放射性標(biāo)記物多以3H-TdR為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。在腫瘤生物學(xué)和細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的研究中，Mayer在試管內(nèi)分析一組人乳腺癌大樣本，比較BrdU和3H-TdR

11、的標(biāo)記效果，3H-TdR標(biāo)記234例，平均LI為6.90.4%；BrdU標(biāo)記450例，平均LI6.40.3%，兩種標(biāo)記物無顯著差異(P0.05)。BrdU和3H-TdR標(biāo)記的腫瘤大小，組織類型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胞核大小以及DNA倍體均正相關(guān)，充分說明兩種標(biāo)記物之間的密切關(guān)系。在同一靶細(xì)胞標(biāo)記也證明90%以上標(biāo)記3H-TdR陽性細(xì)胞也標(biāo)記有BrdU，反之亦然。四、應(yīng)用：BrdU標(biāo)記用于DNA修復(fù)、復(fù)制、分子雜交的重組DNA技術(shù)可替代同位素標(biāo)記，在分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)，腫瘤生物學(xué)、免疫學(xué)、藥理和藥代動(dòng)力等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用價(jià)值。Kitazaws等用BrdU標(biāo)記對(duì)白血病細(xì)胞HL-60和K562

12、基因表達(dá)進(jìn)行研究，將標(biāo)記DNA和RNA原位雜交，發(fā)現(xiàn)80%用于合成DNA的胸腺嘧啶被BrdU替代15。Stevenson等用BrdU單抗和FCM對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞BALb/C，3T3，Colon26等6種細(xì)胞系研究殺瘤性巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒作用對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的影響。受試細(xì)胞系接觸M之前，先經(jīng)BrdU脈沖標(biāo)記，即在適當(dāng)時(shí)間加入B rdU，只作用短時(shí)間馬上洗去，以保證BrdU摻入DNA的精確時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)中，6促細(xì)胞系的細(xì)胞均可被殺瘤性M阻滯在細(xì)胞周期的每一個(gè)時(shí)相內(nèi)16。近幾年來，由于BrdU標(biāo)記方法敏感、簡單和迅速，該技術(shù)在腫瘤增殖動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域的研究也非?；钴S17-20。目前BrdU標(biāo)記

13、不僅用于腫瘤診斷，評(píng)估預(yù)后，對(duì)指導(dǎo)腫瘤治療已受重視，將活檢標(biāo)本LI作為術(shù)后的是否行輔助治療的依據(jù)，尤其對(duì)增大的區(qū)域淋巴結(jié)價(jià)值更大，區(qū)域淋巴結(jié)已轉(zhuǎn)移病例可按LI高低確定化療方案，現(xiàn)已明確小劑量化療后腫瘤復(fù)發(fā)者是LI高的病例，而不是LI低者。值得提出的是BrdU的LI較FCM的DI更客觀可靠，因FCM難于識(shí)別雙相二倍體和異倍體腫瘤DNA分布的S期細(xì)胞，而且DI的S期細(xì)胞數(shù)也可能含有死亡細(xì)胞21。此外已證明BrdU替代腺嘧啶所合成的DNA對(duì)放射性物質(zhì)更敏感，使腫瘤對(duì)放療的敏感性增加22，23?？梢灶A(yù)言，BrdU標(biāo)記作為一種新近倍受重視的材料和方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景將會(huì)十分廣闊。參考文獻(xiàn)Knol

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