脂康調(diào)節(jié)高脂血癥家兔肝臟LDL

1、    脂康調(diào)節(jié)高脂血癥家兔肝臟LDL-R mRNA水平的實(shí)驗(yàn)研究             作者：陳文娜， 李曦明， 時(shí)間：2007-11-22 11:50:00                     【摘要】  目的 

2、; 通過建立新西蘭家兔高脂血癥模型,探討肝臟低密度脂蛋白受體基因水平與高脂血癥形成的關(guān)系。方法  （1）建立高脂血癥家兔模型；（2）應(yīng)用原位雜交方法檢測(cè)肝臟低密度脂蛋白受體基因水平。結(jié)果  （1）成功建立高脂血癥家兔模型；（2）脂康方劑可有效降低血脂水平，并能有效上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體基因水平。結(jié)論  脂康方劑可激活肝臟細(xì)胞膜LDL-R基因表達(dá)，使LDL-R的活性增強(qiáng)，從而加速脂蛋白的分解，有效調(diào)節(jié)血脂水平。      【關(guān)鍵詞】  高脂血癥； 低密度脂蛋白受體； 基因表達(dá)  

3、60;    Study the effect of Zhikang on blood-lipid and low density lipoprotein receptor mRNA in rabbit        【Abstract】  Objective    To study the immune mechanism of Zhikang to control the development of hyperlipidemia.Methods  (

4、1)To set up hyperlipidemia models of New Zealand rabbits.(2)To observe the pathological changes in liver.(3)To study the effects of Zhikang by detecting the levels the gene of low density lipoprotein receptor through ISHH(in situ hybridization histochemistry).  Results  (1)A hyperlipidemia

5、 model was successfully established by using high-fat diet in New Zealand rabbits.(2)Zhikang can effectively reduce the level of lipids and it can increase the levels of the gene of low density lipoprotein receptor.  Conclusion  Zhikang can effectively reduce the level of lipids and improv

6、e the condition of atherosclerosis ,at the same time,it can effectively regulate the immune functions on the levels of gene of low density lipoprotein receptor.  【Key words】  hyperlipidemia;low density lipoprotein receptor;gene expression         

7、60;                  高血脂能導(dǎo)致冠狀血管等全身血管的不同程度硬化，導(dǎo)致各種臨床并發(fā)癥。目前治療血脂異常、動(dòng)脈硬化的西藥雖然在臨床取得了一定的療效，但同時(shí)其對(duì)肝、腎功能會(huì)產(chǎn)生一定的影響，不利于長(zhǎng)期服用。研制毒副作用小，療效顯著、具有多靶點(diǎn)綜合治療效應(yīng)的中藥復(fù)方制劑，是目前中醫(yī)臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)。中藥脂康由黃芪、沙棘、山楂、紅花、丹參、三七粉等組成，具有健脾益氣、祛痰降濁、調(diào)整陰陽氣血和臟腑功能、活血化瘀之功

8、效，適用于高脂血癥及輕中型冠心病，在臨床上應(yīng)用數(shù)年，對(duì)高脂血癥及動(dòng)脈硬化的防治上已取得了很好的療效。脂康通過清除人體內(nèi)的痰濁、瘀血等有害物質(zhì)，抑制脂質(zhì)合成，促進(jìn)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和清除，加速脂質(zhì)排泄等多種途徑調(diào)節(jié)血脂。本實(shí)驗(yàn)主要從基因水平上研究脂康對(duì)高脂血癥家兔肝臟低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，從而探討脂康調(diào)節(jié)血脂的主要機(jī)理。  1  材料與方法  1.1  脂康方藥的制備    本處方由沙棘、山楂、丹參、紅花、黃芪、三七等為主組成。經(jīng)醇提、水提、干燥后制成丸劑，每丸0.5g。等臨床劑量按人和動(dòng)物體表面積換算，相當(dāng)于60kg體

9、重人每日的藥量。    1.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及用藥方法    純種新西蘭大耳白兔60    只，體重1.92.1kg,兔齡4個(gè)月，隨機(jī)選取10只為正常組，喂飼普通顆粒飼料，150gd，其余50只給予高脂飼料（1膽固醇、5蛋黃粉、5豬油、89普通飼料）喂飼，150gd 。于第4周末根據(jù)膽固醇情況隨機(jī)分為5組，每組  10只：模型對(duì)照組給予高脂飼料喂飼，150g/d；其余用藥組除給予高脂飼料喂飼150g/d外，脂康低劑量組給予脂康浸膏0.2 g /（kg·d）；脂康高劑量組給予

10、脂康浸膏0.4 g /（kg·d）；血脂康對(duì)照組給予血脂康0.1g/（kg·d）；辛伐他汀對(duì)照組給予辛伐他汀0.8mg/ （kg·d）。  喂飼8周后，麻醉，心臟取血，用于血脂項(xiàng)目檢測(cè)。取靠近肝門靜脈處的肝臟組織，直徑約2cm，用濃度10福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，用光鏡觀察。另取肝臟組織，直徑約1cm，用濃度4%的多聚甲醛固定后做LDL-R mRNA（原位雜交）檢測(cè)。  1.3  生化指標(biāo)檢測(cè)    分別于用藥前取耳緣靜脈血及用藥后心臟取血10ml，離心3000r/min，10min，取血清

11、分裝，20冰箱保存，血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量測(cè)定采用酶法，根據(jù)Friedward公式法計(jì)算低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，即LDL-C=TC-（TG/2.2+HDL-C)。動(dòng)脈硬化指數(shù)（AIP）為TG與HDL-C摩爾濃度比值的對(duì)數(shù)。血脂檢測(cè)試劑盒（北京中生生物工程高技術(shù)公司生產(chǎn)）。  1.4  肝臟組織LDL-R mRNA原位雜交檢測(cè)  （LDLR ISH 原位雜交試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司提供）。  1.41  實(shí)驗(yàn)步驟    (1)將新鮮的肝組織切成

12、不超過4mm的小塊，并及時(shí)用固定液固定1h。(2)常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切片厚度為68m。(3)石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟，滴加H202，室溫510min以滅活內(nèi)源性酶。(4)暴露mRNA核酸片段:切片上加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶。37 1215min，清洗。(5)后固定:胃蛋白酶消化后在玻片上滴加固定液室溫固定10min，清洗3次。(6)預(yù)雜交:首先將濕盒準(zhǔn)備好，每張切片滴加20l預(yù)雜交液，放入濕盒內(nèi)， 3842 4h，甩去多余的液體。(7)雜交:在每張玻片上滴加20l雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。放恒溫箱雜交過夜。(8)雜交后洗滌。 (9)滴加封閉液:放入

13、37 30min后取出，甩去多余液體，不洗。(10)滴加生物素化鼠抗地高辛:放入37 60min，PBS洗滌。(11)滴加SABC:放入37 30min， PBS洗滌。(12)滴加生物素化過氧化物酶:37恒溫箱中放置30min，PBS洗滌。(13)DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒，滴至玻片上，顯色3050min，充分水洗，蘇木素復(fù)染，充分水洗，酒精脫水，二甲苯透明，封片。  1.42  原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定    光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn):原位雜交結(jié)果以細(xì)胞漿內(nèi)或核膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒者或斑片為陽性細(xì)胞。  1.43 

14、分析方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    計(jì)算機(jī)圖像分析，在圖像卡IBM586和Olympus BX60顯微鏡組成的圖像處理系統(tǒng)上，測(cè)定陽性細(xì)胞數(shù):每組每只大鼠各5個(gè)高倍視野(10×40)下原位雜交陽性細(xì)胞率(%)。  1.5  結(jié)果統(tǒng)計(jì)    計(jì)量資料采用單因素方差分析，F(xiàn)檢驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。  2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果  2.1  血脂水平變化    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示脂康高劑量組對(duì)高脂血

15、癥家兔血清TC、TG、LDL-C水平有顯著的降低作用（P<0.01），對(duì)HDL-C有顯著升高作用（P<0.01）。脂康高劑量與西藥辛伐他汀比較，在降低家兔血清TC、TG、LDL-C的作用相近，升高HDL-C作用優(yōu)于辛伐他汀；與中藥血脂康比較，在降低家兔血清TC、LDL-C的作用明顯優(yōu)于血脂康，降低TG水平作用相近，升高HDL-C水平作用優(yōu)于血脂康。  2.2  肝臟LDL-R mRNA水平變化    肝臟LDL-R mRNA的陽性表達(dá)信號(hào)可見細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組的陽性表達(dá)率，結(jié)果見表1。      正常對(duì)照組與模型對(duì)照組、脂康高劑量組及辛伐他汀對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01),模型對(duì)照組明顯低于其他各組，比較差異有顯著性(P<0.01), 脂康高劑量組明顯高于其余各組。    表1  肝臟LD