土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)導(dǎo)學(xué)案答案

1、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)導(dǎo)學(xué)案答案一、研究培養(yǎng)基對微生物的選擇作用1.篩選菌株(1)自然界中目的菌株的篩選原理：根據(jù)目的菌株對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。實例：能產(chǎn)生耐高溫的Taq DNA聚合酶的Taq細菌就是從熱泉中篩選出來的。(2)實驗室中目的菌株的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。實例：從土壤中篩選能分解尿素的細菌。方法：利用選擇培養(yǎng)基進行微生物的篩選。2.選擇培養(yǎng)基(1)概念：允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。(2)舉例：篩選土壤中分解尿素的細菌的選擇培養(yǎng)基是以尿素為唯

2、一氮源，按物理性質(zhì)歸類為固體培養(yǎng)基。1.篩選分解尿素的細菌的選擇培養(yǎng)基下面是本課題使用的培養(yǎng)基的配方，請分析并回答下列問題：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g瓊脂15.0 g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1 000 mL(1)該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？答案碳源是葡萄糖，氮源是尿素。(2)分離分解尿素的細菌的選擇培養(yǎng)基是如何進行選擇的？答案該選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。(3)為什么只有能分解尿素的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長？答

3、案分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可將尿素分解成氨，從而為微生物提供氮源。2.設(shè)計對照實驗(1)如何設(shè)計對照實驗驗證該選擇培養(yǎng)基的確篩選到了能分解尿素的細菌？答案增設(shè)牛肉膏蛋白胨基礎(chǔ)培養(yǎng)基并進行涂布平板操作，如果牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，則說明選擇培養(yǎng)基的確起到了篩選能分解尿素的細菌的作用。(2)如何設(shè)計對照實驗驗證所用的選擇培養(yǎng)基沒有受到污染？答案設(shè)置一個未涂布平板的能篩選分解尿素的細菌的選擇培養(yǎng)基。歸納總結(jié)選擇培養(yǎng)基的分類(1)利用營養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基進行的選擇培養(yǎng)：通過控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，使營養(yǎng)缺陷型微生物不能正常生長。(2)利用化學(xué)物質(zhì)進行的選擇培養(yǎng)

4、：在完全培養(yǎng)基中加入某些化學(xué)物質(zhì)，利用加入的化學(xué)物質(zhì)抑制某些微生物的生長，同時選擇所需的微生物。(3)利用培養(yǎng)條件進行的選擇培養(yǎng)：改變微生物的培養(yǎng)條件(如高溫、特殊pH等)，篩選特定微生物。1.下列有關(guān)微生物篩選的敘述中，不正確的是()A.用全營養(yǎng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基篩選大腸桿菌B.用高NaCl的培養(yǎng)基篩選抗鹽突變菌株C.含酚紅的尿素培養(yǎng)基篩選鑒別出分解尿素的菌株D.利用高溫條件篩選耐熱的Taq細菌答案A解析全營養(yǎng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基常用于大腸桿菌的培養(yǎng)，該培養(yǎng)基對微生物無選擇作用，A項錯誤；抗鹽突變菌株具有耐高鹽的能力，因此可以利用高NaCl的選擇培養(yǎng)基進行選擇培養(yǎng)，B項正確；分解尿素的菌株能將

5、尿素分解成氨，使培養(yǎng)基pH升高，因此可以利用含酚紅的尿素培養(yǎng)基篩選鑒別出分解尿素的菌株，C項正確；利用高溫條件可以篩選耐熱的Taq細菌，D項正確。2.下表是微生物培養(yǎng)基的成分。下列有關(guān)說法錯誤的是()編號 成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量/g0.44.00.50.5100 mLA.此培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物B.此表中的營養(yǎng)成分共有三類，即水、無機鹽、氮源C.若除去，此培養(yǎng)基可培養(yǎng)圓褐固氮菌D.培養(yǎng)基中若加入氨基酸，則它可充當碳源、氮源和生長因子答案C解析分析題表可知，該培養(yǎng)基成分中含有水、無機鹽、氮源，但不含含碳有機物，可用來培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物，A、B項正確；

6、圓褐固氮菌同化類型為異養(yǎng)型，培養(yǎng)基中必須存在含碳有機物，所以該培養(yǎng)基不能用來培養(yǎng)圓褐固氮菌，C項錯誤。 方法技巧選擇培養(yǎng)基的常見類型(1)分離微生物所用的選擇培養(yǎng)基一定是固體培養(yǎng)基，因為菌落只能在固體培養(yǎng)基上形成。(2)常見的選擇培養(yǎng)基加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。無氮源培養(yǎng)基可以分離固氮微生物。以石油為唯一碳源的培養(yǎng)基，可以分離能消除石油污染的微生物。將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)，可以分離耐高溫的微生物。二、進行微生物數(shù)量的測定1.統(tǒng)計菌落數(shù)目(1)方法：統(tǒng)計樣品中微生物數(shù)量的方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)法。常用來統(tǒng)計活菌數(shù)目的方法是稀釋涂布平

7、板法。(2)統(tǒng)計依據(jù)：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。(3)操作設(shè)置重復(fù)組，增強實驗的說服力與準確性。為保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板進行計數(shù)。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌實際數(shù)目低。(4)計算公式：每克樣品中的菌株數(shù)(CV)M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。2.設(shè)置對照(1)對照實驗：是指除了被測試條件以外，其他條件都相同的實驗。(2)主要目的：排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信

8、度。例如，為了確認培養(yǎng)基是否被雜菌污染，需以不進行接種的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為空白對照。3.實驗操作流程(1)土壤取樣取樣原因：土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱，同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。土壤要求：富含有機質(zhì)，pH接近中性且潮濕。取樣部位：距地表約38 cm的土壤層。(2)樣品稀釋稀釋原因：樣品的稀釋程度直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。稀釋標準：選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30300之間，便于計數(shù)。(3)微生物的培養(yǎng)與觀察培養(yǎng)：根據(jù)不同微生物的需要，控制適宜的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。觀察a.觀察方法：每隔24 h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，最后選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記

9、錄作為結(jié)果。b.菌落的特征：包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等。(4)菌種鑒定原理：細菌合成的脲酶將尿素分解成氨，使培養(yǎng)基的堿性增強。方法：以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，若指示劑變紅，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。4.操作提示(1)無菌操作取土樣的用具在使用前都需要滅菌。實驗操作均應(yīng)在火焰旁進行。(2)做好標記：本實驗使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前應(yīng)標明培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)日期以及平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。(3)制定計劃：對于耗時較長的生物實驗，要事先制定計劃，以便提高工作效率。下面是土壤中尿素分解菌的分離與計數(shù)的實驗流程示意圖，請結(jié)合教材提供的資料

10、分析回答下列問題：1.實驗流程試寫出分離土壤中分解尿素的細菌的實驗流程(用文字和箭頭表示)。答案土壤取樣樣品稀釋取樣涂布微生物培養(yǎng)觀察并記錄結(jié)果細菌計數(shù)。2.統(tǒng)計菌落數(shù)目甲、乙兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。(1)甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230，該同學(xué)的統(tǒng)計結(jié)果是否真實可靠？為什么？答案不真實。為增加實驗的說服力與準確性，應(yīng)設(shè)置重復(fù)實驗，在同一稀釋度下涂布3個平板，統(tǒng)計結(jié)果后計算平均值。(2)乙同學(xué)在該濃度下涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)將21舍去，然后取平均值。該

11、同學(xué)對實驗結(jié)果的處理是否合理？為什么？答案不合理。微生物計數(shù)時，如果實驗中出現(xiàn)重復(fù)實驗的結(jié)果不一致的情況，應(yīng)分析實驗過程中可能的影響因素，找出差異的原因，而不能簡單地舍棄后進行計數(shù)。(3)某同學(xué)在三種稀釋度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)，得到以下的數(shù)據(jù)，試計算1 g樣品的活菌數(shù)。平板稀釋度平板1平板2平板3104320360356105212234287106212318答案105的稀釋度下取0.1 mL涂布的三個平板上的菌落數(shù)在30300之間，計算其平均值為(212234287)/3244。進一步可以換算出1 g樣品中活菌數(shù)為(2440.1)1052.44108個。(4)為什么

12、統(tǒng)計的菌落數(shù)比活菌的實際數(shù)目低？答案當兩個或多個細菌連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。3.對照實驗設(shè)計的分析分析教材P22“設(shè)置對照”中的實例，探討下列問題：(1)在A同學(xué)確定自己操作無誤的情況下，A同學(xué)得出的菌落數(shù)多于其他同學(xué)的原因可能有哪兩種？答案可能是他選擇的土壤樣品不同于其他同學(xué)；也可能是培養(yǎng)基受到了污染或操作失誤。(2)如何設(shè)計對照實驗幫助A同學(xué)排除上述兩個可能影響實驗結(jié)果的因素？答案其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進行實驗，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A同學(xué)操作無誤；如果結(jié)果不同，證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題；將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下培養(yǎng)作為空白對照，

13、以判斷培養(yǎng)基是否受到污染。4.微生物數(shù)量測定的實驗設(shè)計(1)為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？答案土壤中各種微生物的數(shù)量是不同的，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離。(2)本實驗中應(yīng)如何統(tǒng)計培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)？答案每隔24 h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果。(3)實驗中的無菌操作主要有哪些？答案培養(yǎng)基、錐形瓶、試管、鏟子、信封等，需要進行滅菌。稱取土壤要在火焰旁進行。稀釋土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁進行。歸納總結(jié)分離尿素分解菌操作中的注意事項(1)在實驗操作中，每個步驟都要注意無菌操作，以防培養(yǎng)基被污染，影響實驗效果。(2)樣品稀釋液的最佳濃

14、度為培養(yǎng)后每個平板上有30300個菌落的濃度。細菌一般選104、105、106倍稀釋液進行培養(yǎng)，放線菌一般選103、104、105倍稀釋液進行培養(yǎng)，真菌一般選102、103、104倍稀釋液進行培養(yǎng)。(3)為排除非測試因素(培養(yǎng)基)的干擾，實驗需設(shè)置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行空白對照。(4)每一稀釋倍數(shù)的菌液都至少要涂布3個平板，作為重復(fù)實驗，求其平均值，若其中有菌落數(shù)與其他平板懸殊過大的，需要對該平板重新制作。3.如圖為“土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)”實驗中樣品稀釋示意圖。據(jù)圖分析下列敘述正確的是()A.4號試管中稀釋液進行平板培養(yǎng)得到的菌落平均數(shù)一定恰為5號的10倍B.5號試管的結(jié)果表明每克

15、該土壤中的菌株數(shù)目為1.7108個C.在用移液管吸取菌液進行梯度稀釋時，可用手指輕壓移液管上的橡皮頭，吹吸三次，使菌液與無菌水充分混勻D.某一稀釋度下至少涂3個平板，該實驗方法統(tǒng)計得到的結(jié)果常會比實際活菌數(shù)目高答案C4.自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時一般要將它們分離提純，然后進行數(shù)量的測定。下面是對大腸桿菌進行數(shù)量測定的實驗，請回答有關(guān)問題：(1)實驗步驟制備稀釋倍數(shù)為102、103、104、105、106的系列稀釋液。為了得到更加準確的結(jié)果，應(yīng)選用_法接種樣品。適宜溫度下培養(yǎng)。(2)結(jié)果分析測定大腸桿菌數(shù)目時，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，與事

16、實更加接近的是_。A.一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230B.兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是220和260，取平均值240C.三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是400、212和256，取平均值289D.四個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、260、240和250，取平均值240一同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基上測得平板上菌落數(shù)的平均值為212，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)約是(涂布平板時所用的稀釋液體積為0.2 mL)_。用這種方法測定菌體密度時，實際活菌數(shù)量要比測得的數(shù)量_(填“多”或“少”)，因為_。問題導(dǎo)析(1)因為題中操作的目的是對大腸桿菌進行數(shù)量的測定，所以接種的方法是稀釋涂布平板法。(2)測定活菌數(shù)量時，

17、選擇的平板越多誤差越小，且選擇的平板要能形成30300個菌落。(3)所做的多個平板中，如果其中一個平板中菌落的數(shù)目明顯多于或少于其他幾個平板，則說明該平板不符合要求，應(yīng)重做或舍棄。答案(1)稀釋涂布平板(2)D1.06109個多當兩個或多個細菌連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落解析(1)若對大腸桿菌進行計數(shù)，則需要用稀釋涂布平板法接種樣品。(2)應(yīng)選取多個菌落數(shù)相差不大的平板進行計數(shù)，取其平均值。2120.21061.06109(個)。因為一個菌落可能由兩個或多個細菌連在一起生長而成，所以實際活菌數(shù)量要比測得的數(shù)量多。一題多變(1)如果某同學(xué)的稀釋倍數(shù)僅為104，則測定的數(shù)值要比題中測定的

18、數(shù)值高還是低？為什么？答案低。因為稀釋倍數(shù)太低，則大部分菌落是由多個細菌繁殖而成，所以測定的數(shù)值要偏低。(2)第(2)問第小題C項中菌落數(shù)為400的平板不符合要求，試分析該平板中菌落數(shù)目多于其他平板的可能的原因。答案培養(yǎng)基被污染，一些菌落是由雜菌繁殖而成的；接種過程中由于操作不當感染了雜菌；取菌液時沒有搖勻，導(dǎo)致所取菌液中細菌個體濃度偏大等。方法技巧用稀釋涂布平板法計數(shù)微生物的方法(1)稀釋涂布平板操作要求：按照平行重復(fù)的原則，每一稀釋度的菌液涂布3個或3個以上的平板。(2)計數(shù)的時機：當各平板上菌落數(shù)目穩(wěn)定時進行計數(shù)。(3)選擇可用于計數(shù)的平板：選擇菌落數(shù)在30300之間的平板(相同稀釋度的

19、平板均符合該特點)進行計數(shù)，然后取平均值。1.選擇培養(yǎng)基是根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學(xué)抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。為選擇酵母菌和硝化細菌，應(yīng)選用的培養(yǎng)基分別為()A.伊紅美藍培養(yǎng)基、含青霉素的培養(yǎng)基B.含青霉素的培養(yǎng)基、含氨的無機培養(yǎng)基C.含氨的無機培養(yǎng)基、含青霉素的培養(yǎng)基D.含青霉素的培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基答案B解析酵母菌是真菌，通?？梢杂煤嗝顾氐呐囵B(yǎng)基進行選擇培養(yǎng)，因為青霉素能夠抑制細菌生長，但不能夠抑制真菌生長。硝化細菌為自養(yǎng)型生物，能夠利用氨轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛岷拖跛崴尫诺哪芰堪褵o機物轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C物以維持自身生命

20、活動，利用含氨的無機培養(yǎng)基可進行選擇培養(yǎng)。2.下列操作步驟順序正確的是()土壤取樣稱取10 g土樣，加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液進行平板涂布依次稀釋至101、102、103、104、105、106、107稀釋度A.B.C.D.答案C3.對尿素分解菌進行初步鑒定時，可在培養(yǎng)基中加入()A.重鉻酸鉀 B.酚紅指示劑C.剛果紅 D.結(jié)晶紫答案B解析對尿素分解菌進行初步鑒定，可在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。4.從土壤中分離以尿素為氮源的細菌，下列實驗操作不正確的是()A.將土壤用無菌水稀釋，制備103106倍的土壤稀釋液B.將不同濃度的土壤稀釋液涂布于不同平板上C.用加入剛果

21、紅指示劑的選擇培養(yǎng)基篩選分解尿素的細菌D.從周圍出現(xiàn)紅色環(huán)帶的菌落中挑取能夠分泌脲酶的菌株答案C解析用加入酚紅指示劑的鑒別培養(yǎng)基可以鑒別分解尿素的細菌。5.尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)肥料，但若不經(jīng)細菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物種類和數(shù)量繁多，同學(xué)們試圖探究土壤中微生物對尿素是否有分解作用，設(shè)計了以下實驗，并成功篩選到能高效降解尿素的細菌(目的菌)。培養(yǎng)基成分如下表所示，實驗步驟如圖所示。請分析回答下列問題：KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素瓊脂1.4 g2.1 g0.2 g10.0 g1.0 g15.0 g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1 000 mL。(1)此培養(yǎng)基_(填“能”或“不能”)用于植物組織培養(yǎng)，理由是