發(fā)酵過程及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)⒊⒏

1、發(fā)酵過程及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)班級(jí)：08生工1 姓名：顧婷婷 學(xué)號(hào)：060508138一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.溫故配制微生物培養(yǎng)基的原理及配制的一般方法、操作步驟；了解鑒別性培養(yǎng)基的原理，并掌握配制鑒別性培養(yǎng)基的放到和步驟。2.了解分批培養(yǎng)時(shí)微生物生長(zhǎng)曲線形成的原理及各時(shí)期的主要特點(diǎn)。學(xué)習(xí)微生物生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)物形成曲線的測(cè)定方法。3.掌握分光光度法測(cè)定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法，掌握在微生物分批培養(yǎng)時(shí)酶活力測(cè)定的基本方法。4.了解發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)物形成的影響，用單因子試驗(yàn)找出實(shí)驗(yàn)菌株的最佳培養(yǎng)條件。5.掌握發(fā)酵培養(yǎng)基的配制原則，熟悉用正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理鑒別性培養(yǎng)基是一

2、類在成分中加有能與目的菌的無(wú)色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只需用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌菌落的培養(yǎng)基。如對(duì)于淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選，選用的是在含有淀粉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，滴加碘液進(jìn)行染色，若出現(xiàn)透明圈，則表明該菌能產(chǎn)生胞外淀粉酶。將少量微生物接種到一定體積的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中微生物的生長(zhǎng)量（吸光度或活菌數(shù)的對(duì)數(shù)），以生長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制的曲線就是生長(zhǎng)曲線，它反映了微生物在一定環(huán)境條件下的群體生長(zhǎng)規(guī)律。依據(jù)生長(zhǎng)速率的不同，一般可把生長(zhǎng)曲線分為延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。這四個(gè)時(shí)期的長(zhǎng)短因菌種的遺傳特性、接種量

3、和培養(yǎng)條件而異。因此，通過微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，可了解微生物的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)于科研和生產(chǎn)實(shí)踐都具有重要的指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)采用比濁法來(lái)測(cè)定。由于菌懸液的濃度與吸光值（A）也稱光密度成正比，只要用分光光度計(jì)測(cè)得菌液的A后與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌株的生長(zhǎng)曲線。產(chǎn)物形成曲線就是產(chǎn)物產(chǎn)量對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的曲線。學(xué)會(huì)生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)物形成曲線的測(cè)定對(duì)工業(yè)發(fā)酵具有非常重要的指導(dǎo)意義。淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷鍵的一類酶。淀粉遇碘呈藍(lán)色。這種淀粉-碘復(fù)合物在660nm處有較大的吸收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。隨著酶的不斷作用，淀粉長(zhǎng)鏈被切斷，生成小分子糊精，使其對(duì)碘的藍(lán)色反應(yīng)逐漸消失 ，因此可以根據(jù)一定時(shí)

4、間內(nèi)藍(lán)色消失的程度為指標(biāo)來(lái)測(cè)定-淀粉酶的活力。發(fā)酵培養(yǎng)基是指大生產(chǎn)時(shí)所用的培養(yǎng)基，由于發(fā)酵產(chǎn)物中一般含有較高比例的碳元素，因此培養(yǎng)基中的碳源含量也應(yīng)該比種子培養(yǎng)基中高。培養(yǎng)基組分對(duì)發(fā)酵起著關(guān)鍵性的影響作用。發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料多是大分子物質(zhì)，微生物一般不能直接吸收，必須通過胞外酶的作用后才能被利用，所以是一些“遲效性”營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。而微生物分泌的胞外酶有不少是誘導(dǎo)酶，為了使發(fā)酵起始階段微生物能快速繁殖，可適當(dāng)在培養(yǎng)基中添加一些速效營(yíng)養(yǎng)物。三材料與器材1 菌種 枯草芽孢桿菌2. 培養(yǎng)基普通培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，自來(lái)水1000mL，pH7.27.4。鑒別型培養(yǎng)基：牛肉膏3g，

5、蛋白胨10g，可溶性淀粉10g， NaCl 5g，瓊脂20g，自來(lái)水1000mL，pH7.27.4。3. 器皿：電子天平，燒杯，錐形瓶，量筒，培養(yǎng)皿，玻棒，涂布棒，移液管，pH試紙，棕色瓶，容量瓶，高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，分光光度計(jì)，搖床，恒溫水浴鍋等。4.藥品：牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，蒸餾水，可溶性淀粉，瓊脂，NaOH, 碘化鉀，碘，十二水合磷酸氫二鈉，檸檬酸，乙酸，葡糖糖，果糖，蔗糖，乳糖。5.試劑（1） 碘原液：稱取碘化鉀22g，加少量蒸餾水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，貯于棕色瓶中。（2） 比色稀細(xì)碘液：取碘原液2mL，加碘化鉀20g，用蒸餾水定容至500mL，貯于棕

6、色瓶中。（3） 2%可溶性淀粉：稱取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸餾水混合調(diào)勻，倒入煮沸的蒸餾水中，邊加邊攪拌，煮沸2min后冷卻，加水定容至100mL。須當(dāng)天配制。（4） pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）4.523g，檸檬酸0.807g，用水溶解并定容至100mL。（5） 0.5mL/L乙酸溶液，0.85%生理鹽水。6.其他：藥匙，記號(hào)筆，報(bào)紙等。四、方法和步驟（一）培養(yǎng)基的配置、滅菌1. 配制基本培養(yǎng)基1500ml , 分裝50mL至250mL錐形瓶，共23瓶，供實(shí)驗(yàn)菌株擴(kuò)增。2配制鑒別培養(yǎng)基（可溶性淀粉10g/L和15g/L兩種）各1

7、00ml，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株是否能產(chǎn)胞外淀粉酶。3配制稀釋用的生理鹽水，分裝4.5mL至每個(gè)試管。3包扎培養(yǎng)皿、錐形瓶，移液管等。4121，滅菌20min。（二）生長(zhǎng)曲線的測(cè)定1. 將實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)過適當(dāng)稀釋涂布在鑒別性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，在菌落周圍滴加碘液，根據(jù)透明圈的大小，挑取合適的單菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2. 將選擇的菌挑取到新鮮的基本培養(yǎng)基中，放置搖床上30，180rpm培養(yǎng)，過夜。3. 將第2步中培養(yǎng)得到的菌懸液搖勻，吸取0.5mL接入新鮮基本培養(yǎng)集中，30，180rpm培養(yǎng)，每隔4h取一瓶，在560nm處測(cè)吸光度，以未接種、但已滅菌的基本培養(yǎng)基作對(duì)照；每隔2小時(shí)取次樣。4. 以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸

8、光值為縱坐標(biāo)，作生長(zhǎng)曲線。（三）產(chǎn)物形成曲線的測(cè)定同上，在進(jìn)行生長(zhǎng)量測(cè)定的同時(shí)，進(jìn)行產(chǎn)物形成量（淀粉酶活力）的測(cè)定，以培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物形成量為縱坐標(biāo)，作出產(chǎn)物形成曲線。（四）液化型淀粉酶活力的測(cè)定1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1） 將可溶性淀粉稀釋成0.2%，0.5%，1%，1.5%和2%的稀釋液。（2） 吸取淀粉稀釋液2.0mL加至試管中，再加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.0mL，40水浴保溫5min。（3） 加蒸餾水1mL，40保溫30min后加入0.5mol/L乙酸10mL。（4） 吸取反應(yīng)液1mL，加稀碘液10mL，混勻，在660nm下測(cè)得吸光度A（用2.0mL蒸餾水代替步驟（2）中的淀粉

9、稀釋液作為對(duì)照）。（5） 以淀粉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 淀粉酶活力測(cè)定用2%可溶性淀粉按1（2）操作，用稀釋后的粗酶液1mL代替1（3）中的蒸餾水，測(cè)得吸光度A660，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的淀粉濃度，求出被酶消耗的淀粉量。管號(hào)12345678910淀粉稀釋液/mL2222222222緩沖液/mL111111111140水浴鍋保溫5min蒸餾水/mL1111111111粗酶液/mL111111111140保溫30min，然后加入0.5mol/L乙酸10mL，混勻吸取反應(yīng)液1mL稀碘液/mL10101010101010101010A6603酶活力計(jì)算 酶活力以每毫升粗酶液在4

10、0，pH6.0的條件下每小時(shí)所分解的淀粉毫克數(shù)來(lái)衡量。（五）實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)基條件的優(yōu)化1. 將實(shí)驗(yàn)菌株接種至新鮮的基本培養(yǎng)基中，30C培養(yǎng)過夜。2. 配制新鮮的基本培養(yǎng)基750ml，分5份每份150ml，分別加入葡萄糖（20g/L）、可溶性淀粉（18g/L）、果糖（20g/L）、蔗糖（18g/L）和乳糖（20g/L）。121C,20min,高壓蒸汽滅菌。3. 取上述菌懸液0.5ml接種至各個(gè)培養(yǎng)基中，30，180rpm培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間以之前測(cè)出酶活最高點(diǎn)為準(zhǔn)。4. 檢測(cè)各個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌株的菌含量及酶活量。五 結(jié)果記錄一）1. 透明圈-透明圈 圖12. 不同淀粉濃度、不同菌濃下涂布培養(yǎng)的菌落

11、數(shù)淀粉濃度(g/L)菌懸液的濃度梯度菌落數(shù)平均值1010-511010710910-69101010-73539371510-413013713410-5323735二）1 數(shù)據(jù)記錄培養(yǎng)時(shí)間/h04812162024283236A5600.0020.0040.0060.0180.1250.1850.0570.0890.8940.543A6600.550.570.5710.5560.5160.4790.0650.0790.0730.0823 繪制出實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)曲線和淀粉酶活力圖。淀粉酶活力的計(jì)算：從下圖3做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，查出對(duì)應(yīng)時(shí)間下A660的淀粉濃度，求出被酶消耗的淀粉量，從而計(jì)算出酶活力

12、。培養(yǎng)時(shí)間/h04812162024283236A6600.550.570.5710.5560.5160.4790.0650.0790.0730.082淀粉濃度/%1.7211.7781.7801.7381.6241.5190.3430.3830.3660.391消耗淀粉量/(mg/ml)2.7932.2242.1962.6223.7594.81016.57116.1716.34416.088酶活力1.3961.1121.0981.3111.8792.4058.2868.0878.1728.044圖 2OD560值隨時(shí)間的推移總體呈現(xiàn)先升高后下降的走勢(shì)，即在一段時(shí)間內(nèi)枯草芽孢桿菌量不斷增加，超

13、過這一時(shí)間后由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少，細(xì)菌數(shù)量反而減少。淀粉酶的活力也是隨時(shí)間推移先升高后下降。三）淀粉酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖 3四) 繪制出各個(gè)碳源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖，并用文字加以說明。不同碳源A560A660葡萄糖0.8170.287可溶性淀粉0.8970.037果糖0.7850.28蔗糖0.6380.414乳糖0.5260.019圖4 不同碳源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)量由大到小順序?yàn)椋嚎扇苄缘矸?、葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖。圖5不同碳源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)酶酶活力由大到小順序?yàn)椋喝樘?、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖。綜上兩圖，以淀粉為碳源就可得到較多的菌株以及產(chǎn)生較多的淀粉酶。六思考題1. 如若通過鑒別性培

14、養(yǎng)基鑒定該實(shí)驗(yàn)菌株不產(chǎn)生透明圈，是否可以認(rèn)定該菌就不產(chǎn)淀粉酶？原因是什么？ 不可以?？赡墚a(chǎn)生的淀粉酶過少，透明圈不明顯；培養(yǎng)時(shí)間不夠，還沒有開始產(chǎn)淀粉酶。2 如果每次從同一搖瓶中取出1mL進(jìn)行測(cè)定，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生怎么樣的影響？ 可能會(huì)使后面的吸光值變小，每次取出一些，會(huì)使培養(yǎng)液含量減少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變少，從而影響菌的繁殖與生長(zhǎng)，那么就不是單個(gè)因素時(shí)間不同而已，培養(yǎng)基量也不同，做出的曲線不準(zhǔn)確。3 本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)物形成量用淀粉酶活力來(lái)表征，是否合適？為什么？ 合適。產(chǎn)生的淀粉酶用來(lái)分解淀粉正好是酶活力在此次試驗(yàn)的定義即以每毫升粗酶液在40，pH6.0的條件下每小時(shí)所分解的淀粉毫克數(shù)。4 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得曲線，

15、我們可以得到哪些結(jié)論？ 一段時(shí)間內(nèi)枯草芽孢桿菌量不斷增加，超過這一時(shí)間后由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少，細(xì)菌數(shù)量反而減少。而酶的活力也隨時(shí)間先升后降，此處有一個(gè)最佳的培養(yǎng)時(shí)間，也就酶活力最高時(shí)的時(shí)間。這個(gè)時(shí)間用于培養(yǎng)基條件的優(yōu)化時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。5. 查閱相關(guān)資料，提出切實(shí)可行的提高酶活量的相關(guān)措施。1）培養(yǎng)基的成分以及含量應(yīng)該選擇最佳的量；2）最佳的培養(yǎng)時(shí)間和溫度； 3) 保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，先接種于新鮮固體培養(yǎng)基上活化，使細(xì)胞生命活性恢復(fù)；4)溫度、pH等條件適宜。6. 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的思路，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)考察不同氮源的種類及含量對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。 1）將實(shí)驗(yàn)菌株接種至新鮮的基本培養(yǎng)基中，30C培養(yǎng)過夜。 2) 查閱資料，選定培養(yǎng)基中氮源的含量，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的植物蛋白、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨的量（以碳含量相同為準(zhǔn)則）；配置相應(yīng)培養(yǎng)基。3) 將上述菌懸液以0.2ml的接種量接種至各個(gè)培養(yǎng)基中，30，180rpm培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間以之前測(cè)出酶活最高點(diǎn)為準(zhǔn)。4） 檢測(cè)各個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌株的菌含量及酶活量。七實(shí)驗(yàn)小結(jié) 在此次實(shí)驗(yàn)中有很多要注意的事項(xiàng)，微生物的發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)要絕對(duì)的注意無(wú)菌的操作，這是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵也是最大的前提。在將實(shí)驗(yàn)菌株從平板上用無(wú)菌生理鹽水沖下時(shí)，要注意一定要沖洗干凈，并且迅速的進(jìn)行梯度的稀釋以及涂布，在吸取菌懸液是，要晃動(dòng)下以免菌沉聚在底層，而沒有