


下載本文檔
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、手把手教你在線做PCR引物設(shè)計POST by Bingsen Xu前言:我是剛剛注冊到丁香園,在PCR技術(shù)討論版看見置頂貼,“請求助引物設(shè)計的戰(zhàn)友先進(jìn)來這里!”稍微瀏覽了一下,發(fā)現(xiàn)很多朋友對PCR引物設(shè)計還不是很熟悉,我愿意把自己積累的一點引物設(shè)計方面的經(jīng)驗和大家分享,希望不會做引物設(shè)計的朋友看完之后,可以不用再發(fā)求助貼而是自己動手做引物設(shè)計或者引物檢驗。開始之前:其實非常簡單,不需要你下載任何軟件,但是你得有一臺電腦能上網(wǎng)。當(dāng)然,最重要的是,你要很清楚用于做引物的模板序列,至于怎么找模板序列,不再本貼的討論范圍。另外,要先對PCR目的序列的長度有個大致估計,好了,馬上開始吧:第一步:找到Pr
2、imer3的站點。你不用記住這個站點,但是要記住“Primer3”這個詞,然后打開GOOGLE首頁,輸入Primer3,跳出來的第一個項目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”網(wǎng)址是。第二步:貼上模板序列。進(jìn)入Primer3站點,可以看到一個引物設(shè)計的界面。(附件Word文檔里有圖)在“Paste source sequence below (5'->3'.”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進(jìn)去。注意是5'->3'方向的,數(shù)字或者空格都沒關(guān)系,軟件會自動過濾的。第三步:
3、重要參數(shù)設(shè)定。首先是“Product Size Ranges”,如果你不希望軟件給你隨便做的話,首先要調(diào)整的就是這個參數(shù)。默認(rèn)的參數(shù)實際上是從100到1000,這個你得自己改,如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期,盡可能把范圍改小,比如480-500,具體看情況調(diào)整。第二個參數(shù)是“Primer Size”,默認(rèn)值一般可以用,但是,當(dāng)你用熟了這個軟件,你自己就知道該怎么改了。第三個參數(shù)是”Primer Tm”這個和Primer Size差不多。第四步:Pick primers: 點一下這個按鈕,符合你大小預(yù)期的primer就出來了,看看Primer3 Output的界面,多么漂亮!你要的primer
4、出來了,而且有primer在序列上的位置比對圖,還要primer本身的信息,包括位置,長度,Tm,GC含量,任何位置互補(bǔ)堿基數(shù),3'端互補(bǔ)堿基數(shù),以及引物序列,(注意,下游引物是5'->3'),還要產(chǎn)物大小,兩引物間任意互補(bǔ)堿基數(shù),兩引物間3'端互補(bǔ)堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設(shè)定的范圍內(nèi),但還不是最佳,將會給出警告。比如(隨便舉例,本人在做一個超長引物):WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stabilityOLIGO start len tm gc% any 3' seq LEFT
5、PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCE SIZE: 1388INCLUDED REGION SIZE: 1388PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00第五步:引物設(shè)計檢驗:可以僅僅設(shè)計一向引物,只要在Pick left p
6、rimer或者Pick right primer前面的勾勾掉一個就可以。也可以自己定義引物,放在Primer框里,(注意,下游引物的書寫反向仍然是5'->3')如果符合設(shè)定的條件,軟件將對給出引物評分,同時給出警告信息,根據(jù)警告信息可以適當(dāng)對自定義引物做些調(diào)整即可,警告信息也讓你做實驗的時候心中有數(shù)。對于文獻(xiàn)發(fā)表的引物,最好都要檢查一下,這樣就可以避免被別人有意無意誤導(dǎo)。至于RT-PCR所用的引物,最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子,這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。實際做引物的時候,要把內(nèi)含子都去掉,僅僅把外顯子序列放入源序列框中,并且通過自定義引物設(shè)計的方法,使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內(nèi)含子和外顯子以及電子PCR,我將抽空另做說明。至于設(shè)計出來的引物的實
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 數(shù)學(xué)必修2試題及答案
- 道路交通安全教案
- 輪崗交流心得體會
- 超市員工辭職申請書怎么寫
- 2025家居裝修工程設(shè)計合同范文
- 2025合同模板水利工程施工監(jiān)理合同條文解釋范本
- 2025地鐵建設(shè)合同范本
- 2025年至2026年通信基站租賃合同范本
- 幼教教師考試試題及答案
- 2025物流服務(wù)轉(zhuǎn)讓合同協(xié)議書
- 區(qū)間邏輯檢查設(shè)備原理、維護(hù)及故障處理
- 《鋼鐵是怎樣煉成的》讀書分享課件
- 汽車裝備制造產(chǎn)業(yè)園項目投資計劃書
- 動漫設(shè)計畢業(yè)論文當(dāng)代中國動漫的思考
- 大班數(shù)學(xué)《錢幣換算》課件
- 面向?qū)ο蟪绦蛟O(shè)計(C++)智慧樹知到課后章節(jié)答案2023年下北方工業(yè)大學(xué)
- 《2氣體的等容變化和等壓變化》教學(xué)設(shè)計(廣東省縣級優(yōu)課)-物理教案
- 《聲樂》(鄭霞)695-9教案 第25課 演唱《我愛你中國》《在那遙遠(yuǎn)的地方》
- GB/T 39390-2023定制家具質(zhì)量檢驗及質(zhì)量評定
- 材料力學(xué)-西北工業(yè)大學(xué)中國大學(xué)mooc課后章節(jié)答案期末考試題庫2023年
- 2023年國開大學(xué)期末考復(fù)習(xí)題-02312-財務(wù)管理
評論
0/150
提交評論