手把手教你做PCR引物設(shè)計(jì)

1、手把手教你在線做PCR引物設(shè)計(jì)POST by Bingsen Xu前言：我是剛剛注冊到丁香園，在PCR技術(shù)討論版看見置頂貼，“請求助引物設(shè)計(jì)的戰(zhàn)友先進(jìn)來這里！”稍微瀏覽了一下，發(fā)現(xiàn)很多朋友對PCR引物設(shè)計(jì)還不是很熟悉，我愿意把自己積累的一點(diǎn)引物設(shè)計(jì)方面的經(jīng)驗(yàn)和大家分享，希望不會做引物設(shè)計(jì)的朋友看完之后，可以不用再發(fā)求助貼而是自己動手做引物設(shè)計(jì)或者引物檢驗(yàn)。開始之前：其實(shí)非常簡單，不需要你下載任何軟件，但是你得有一臺電腦能上網(wǎng)。當(dāng)然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本貼的討論范圍。另外，要先對PCR目的序列的長度有個大致估計(jì)，好了，馬上開始吧：第一步：找到Pr

2、imer3的站點(diǎn)。你不用記住這個站點(diǎn)，但是要記住“Primer3”這個詞，然后打開GOOGLE首頁，輸入Primer3，跳出來的第一個項(xiàng)目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”網(wǎng)址是。第二步：貼上模板序列。進(jìn)入Primer3站點(diǎn)，可以看到一個引物設(shè)計(jì)的界面。（附件Word文檔里有圖）在“Paste source sequence below (5'->3'.”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進(jìn)去。注意是5'->3'方向的，數(shù)字或者空格都沒關(guān)系，軟件會自動過濾的。第三步：

3、重要參數(shù)設(shè)定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調(diào)整的就是這個參數(shù)。默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如480-500，具體看情況調(diào)整。第二個參數(shù)是“Primer Size”，默認(rèn)值一般可以用，但是，當(dāng)你用熟了這個軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個參數(shù)是”Primer Tm”這個和Primer Size差不多。第四步：Pick primers： 點(diǎn)一下這個按鈕，符合你大小預(yù)期的primer就出來了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer

4、出來了，而且有primer在序列上的位置比對圖，還要primer本身的信息，包括位置，長度，Tm，GC含量，任何位置互補(bǔ)堿基數(shù)，3'端互補(bǔ)堿基數(shù)，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），還要產(chǎn)物大小，兩引物間任意互補(bǔ)堿基數(shù)，兩引物間3'端互補(bǔ)堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設(shè)定的范圍內(nèi)，但還不是最佳，將會給出警告。比如（隨便舉例，本人在做一個超長引物）：WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stabilityOLIGO start len tm gc% any 3' seq LEFT

5、PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCE SIZE: 1388INCLUDED REGION SIZE: 1388PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00第五步：引物設(shè)計(jì)檢驗(yàn)：可以僅僅設(shè)計(jì)一向引物，只要在Pick left p

6、rimer或者Pick right primer前面的勾勾掉一個就可以。也可以自己定義引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的書寫反向仍然是5'->3'）如果符合設(shè)定的條件，軟件將對給出引物評分，同時給出警告信息，根據(jù)警告信息可以適當(dāng)對自定義引物做些調(diào)整即可，警告信息也讓你做實(shí)驗(yàn)的時候心中有數(shù)。對于文獻(xiàn)發(fā)表的引物，最好都要檢查一下，這樣就可以避免被別人有意無意誤導(dǎo)。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。實(shí)際做引物的時候，要把內(nèi)含子都去掉，僅僅把外顯子序列放入源序列框中，并且通過自定義引物設(shè)計(jì)的方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內(nèi)含子和外顯子以及電子PCR，我將抽空另做說明。至于設(shè)計(jì)出來的引物的實(shí)